邻苯二甲酸单苄酯单克隆抗体的制备

目的制备抗邻苯二甲酸单苄酯(mono-benzyl phthalate,MBzP)的单克隆抗体。方法本实验利用活泼酯法,将邻苯二甲酸单苄酯分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,获得完全抗原MBzP-BSA和MBzP-OVA,用MBzP-BSA免疫Balb/c小鼠,制备杂交瘤细胞,利用ELISA方法检测阳性杂交瘤细胞株分泌抗体的效价。结果获得了稳定分泌抗MBzP的细胞株1B9,以该细胞株体内诱生腹水制备腹水型单克隆抗体,纯化后效价为1∶128 000。结论成功制备了抗邻苯二甲酸单苄酯的单克隆抗体。     

大田软海绵酸液相色谱串联质谱检测方法的研究

目的:利用高效液相色谱-串联质谱法建立海产品中大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的检测方法。方法:贝样品提取液经AccuBondⅡSPE silica固相萃取小柱预分离和富集,用三级四极杆串联质谱(MS/MS)作为HPLC的检测器,使用正离子电喷雾(ESI)电离方式,多反应监测(MRM)扫描模式,选择母→子离子对m/z827→m/z723,m/z827→m/z809作为定量检测的离子对,HPLC的流动相为乙腈:1%甲酸-水(体积比70:30),色谱柱为Agilent Extend-C18(2.1×150 mm,Φ5.0μm),对OA标准品及加标样品和实际样品进行HPLC-MS/MS检测。结果:方法线性回归方程为Y=193.07X-780.6(Q1/Q3:m/z827.4→723.5);Y=83.021X-335.6(Q1/Q3:m/z827.4→809.5),相关系数r2均为0.9991;线性范围为10~800μg/L。样品平均回收率为83.99%,平均RSD为4.34%。结论:建立的HPLC-MS/MS方法灵敏、快速、准确,可用于海产品中贝类样品OA限量标准检测。     

大腹园蛛Avg 1的原核表达及生物学活性

[目的]研究大腹园蛛组织蛋白酶B相关基因Avg 1(基因登录号:AY302573)编码蛋白的生物学特性.[方法]设计合成引物(AvgS,AvgX),扩增Avg 1,去除信号肽部分基因Avg,将其与原核表达载体pET-28a(+),pET-20b连接,转化到E.coliBL21(DE3)中.[结果]鉴定为阳性克隆后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示Avg-28a-DE3在近35.7ku处出现明显的表达带,其大小与预计分子质量(35.2ku)相当;经薄层扫描分析显示,表达蛋白量占菌体蛋白总量的39.6%,且表达形式主要为包涵体,而Avg-20b-DE3表达产物未见表达带,但RT-PCR方法检测到了Avg mRNA的转录;将表达的包涵体蛋白进行变性及复性处理,与诱导的Avg-20b-DE3表达菌经超声波碎菌处理上清液一同进行蛋白酶活性测定,呈复性的包涵体蛋白不具有酶活性,而Avg-20b-DE3的碎菌上清液显示明显的蛋白酶活性.表达的包涵体蛋白经电洗脱纯化后,常规方法免疫吉绒獭兔,抗血清经ELISA法检测,呈明显阳性反应,经Western blot检测在35.7ku处出现特异结合带.[结论]Avg 1原核表达蛋白具有良好的免疫原性.     

食源性致病菌六联融合毒素的构建及免疫学特性研究

[目的]构建4种食源性致病菌融合毒素基因及重组表达载体,制备六联融合毒素的血清抗体. [方法]采用柔性Linker序列(G-G-G-G-S)对目的基因进行串联(HblA-VT1B-SEA-VT2B-BoNTaHc-SEB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在E.coli BL21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫豚鼠制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性. [结果]成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在E.coli BL21中成功表达,37℃表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量10.2%),基因序列全长3 384bp,编码1 127个氨基酸,蛋白分子量为127 205,测序结果与设计序列一致性为100%.ELISA和琼脂扩散试验表明,融合毒素F6与4种食源性致病菌有良好的反应原性,与多种非目标菌不反应. [结论]成功构建了多联融合毒素基因的表达质粒及制备了抗血清,为利用融合毒素的方法检测食源性致病菌,进而建立食源性致病菌广谱、快速的检测方法奠定基础.     

重金属镉单克隆抗体的制备

重金属对环境及人类存在潜在的持续的毒害作用,建立一种规范的程序,对重金属实施有效的监测。传统的重金属检测方法多采用化学方法检测,如原子吸收光谱分析（atomic abs orption spectroscopy, AAS）、电感耦合等离子发射光谱（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES）等,这些方法需要大量的样品预处理,     

食物中毒菌多联融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的表达及免疫学特性研究

目的构建食物中毒菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备抗5种毒素的血清抗体。方法采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌的5个毒素基因片段进行串联,并定向克隆到表达载体pET-22b(+)的NcoI和XhoI位点之间,构建五联融合毒素基因及重组表达载体,表达产物经切胶回收初步纯化后免疫獭兔,制备抗血清,利用ELISA和琼脂扩散试验检测抗体和5种毒素反应的特异性和敏感性。结果构建了重组融合毒素(命名为F5)Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因和重组表达载体F5-22b,且在表达宿主菌E.coliBL21中得到有效表达(9.90%),基因序列全长2937bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,融合蛋白分子量112.369ku,测序结果与设计序列(GenBank)100%同源。表达产物经初步纯化后免疫獭兔获得抗五种毒素的血清抗体,且具有较高的特异性和敏感性。结论成功构建了融合毒素基因,获得了抗五种毒素的血清抗体,本实验结果为下一步建立食品广谱、快速免疫学检测新方法奠定了基础。     

β-酪蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

牛奶具有丰富的营养价值,牛奶中含有多种人类赖以生存的营养素,包括水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素等,是人类最理想的天然食品。然而近些年来,随着乳制品产量的逐渐上升,乳品掺假现象也时有发生,严重危害消费者健康。     

我国牛羊主产区小肠结肠炎耶尔森菌的病原特征研究

目的 对2018-2020年我国牛羊主产区牛羊源小肠结肠炎耶尔森菌进行病原特征研究,为该菌的防控提供科学依据。方法 对来自于6个地区的2 291份样本进行分离培养、PCR鉴定、玻片凝集以及药敏试验,以掌握其感染情况、毒力基因型和血清型的分布以及耐药情况。结果 在2 291份样本中,共分离出该菌109株,总检出率为4.76%,其中辽宁地区检出率最高(20.42%),并且各地区检出率差异有统计学意义(χ²=288.153,P<0.01),而各种类样本检出率差异无统计学意义(χ²=1.734,P>0.05)。在本次分离菌株中,ystB基因为优势毒力基因,O∶5,27为优势血清型,菌株对氨苄西林、红霉素、磺胺异恶唑和头孢噻吩耐药率为100%,对多粘菌素B和氟苯尼考敏感率为100%。结论 牛、羊源小肠结肠炎耶尔森菌在全国牛、羊主产区分布不广泛,但其多重耐药率较高,建议加强对该菌耐药性的监测与管理。     

食物中毒菌多联融合毒素F5基因的构建及结构分析

目的：构建食物中毒菌多联融合毒素基因并分析其是否保持了原来毒素基因的抗原特性。方法：采用一定的linker序列（G-P-G-P-G）将克隆的3种食物中毒菌5个毒素基因片段进行串联,构建重组融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB（命名为F5）基因,应用DNAstar,对F5融合蛋白抗原特性等进行预测分析。结果：构建的融合毒素F5保留了5种毒素的抗原特性,基因全长序列2 937 bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,测序结果与设计序列（GeneBank）100%同源。结论：成功构建了食物中毒菌多联融合毒素F5基因,为下一步研究融合毒素F5的表达及利用融合毒素检测食物中毒菌毒素建立广谱免疫学检测新方法奠定了基础。     

区别检测小肠结肠炎耶尔森氏菌与布鲁氏菌LAMP引物的设计与分析

目的小肠结肠炎耶尔森氏菌（耶氏菌）和布鲁氏菌都是人兽共患细菌病的主要病原菌,血清学检测过程中,两者常出现交叉反应,尤其是O：9型耶氏菌与布鲁氏菌干扰更为明显。本实验目的是在DNA水平上区别检测这两种致病菌。方法根据耶氏菌outL基因设计一套可用于环介导等温扩增（LAMP）检测方法的引物,拟采用该项特异性强、灵敏性高、操作简单的核酸检测技术,对两种菌进行检测。结果LAMP方法检测耶氏菌结果为阳性,检测布鲁氏菌结果为阴性。结论成功地在DNA水平上区别检测这两种致病菌。并且为建立耶氏菌的非特异性干扰小的LAMP检测方法提供可应用的引物,同时也为LAMP技术的开发应用以及LAMP引物设计提供应用参考。