两种多位点聚合酶链反应技术在结核分枝杆菌复合群鉴定中的价值

目的评价多位点聚合酶链反应(PCR)在儿童结核分枝杆菌复合群鉴定中的临床价值。方法收集经初步鉴定为结核病分支杆菌的临床分离株,分别经传统PNB/TCH鉴定,以及选择7基因位点16SrRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8及Rv3120,及4基因位点ropB、RD1、RD8(present)、RD8(deleted),采用聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增和鉴定。结果共收集204株临床分离菌株,传统PNB/TCH鉴定结果为,结核分枝杆菌199株,牛结核分枝杆菌3株,非结核分枝杆菌2株。4位点PCR鉴定结果为,结核分枝杆菌196株,牛结核分枝杆菌2株,卡介苗3株,非结核分枝杆菌3株。7位点PCR鉴定结果为,结核分枝杆菌191株,牛结核分枝杆菌2株,卡介苗3株,非洲分枝杆菌Ⅰ型4株,山羊分枝杆菌和田鼠分枝杆菌各1株,非结核分枝杆菌2株。结论两种PCR方法均较传统方法简便快捷,且均可较快的鉴定结核分枝杆菌复合群更多的亚种。7位点能鉴定出除非洲分枝杆菌Ⅱ型以外的所有儿童结核分枝杆菌复合群的亚种。4位点在鉴定卡介苗菌株中更加迅速简便。     

结核分枝杆菌北京基因型菌株与重庆地区结核患儿耐药表型的相关分析

目的 研究结核分枝杆菌北京基因型菌株与结核患儿耐药表型及其相关因素.方法 采用定向缺失多重酶链聚合反应技术(deletion-targeted multiplex PCR,DTM-PCR)对从143例患儿分离得到的结核分枝杆菌进行北京基因型菌株鉴定,并使用绝对浓度法进行药敏实验.收集患者的性别、年龄、居住地、卡介苗接种史和结核性脑膜炎病史等相关因素资料.采用χ2检验和Fisher确切概率法分析北京基因型与相关因素以及耐药表型之间的关系.结果 在143株结核分枝杆菌中,91株为北京基因型,占63.6%,北京基因型菌株与年龄、性别、居住地、卡介苗接种和结核性脑膜炎无关(P>0.05).北京基因型菌株在耐链霉素菌株(16.5%,15/91)和耐异烟肼菌株(15.4%,14/91)中的比例显著高于非北京基因型(3.8%,2/52;3.8%,2/52)(P<0.05).结论 北京基因型菌株是重庆地区儿童结核患者中流行的优势菌群,患儿的年龄、性别、居住地、是否接种卡介苗和是否为结核性脑膜炎与北京基因型菌株无关,感染北京基因型菌株的结核患儿更易出现链霉素和异烟肼耐药.     

血小板体积及分布宽度检测儿童川崎病价值

目的 平均血小板体积(MPV)与血小板分布宽度(PDW)与血小板功能有关,相比血小板数量可能更能成为血小板功能异常的敏感指标。研究血小板参数在川崎病中的变化及临床意义。方法 本研究共回顾性分析439例KD患儿和261例健康对照儿童;统计分析患儿的临床资料及实验室检查MPV、PDW、血小板数量(PLT)、WBC、CRP和血沉指标。根据心脏彩色超声有无冠状动脉损伤,将川崎病患儿分为:伴冠状动脉损伤组(CALs组)、不伴冠状动脉损伤组(非CALs组)。同时,比较了完全性川崎病组(cKD)与不完全川崎病组(iKD)各指标的差异。结果 与健康对照组比较,KD组WBC、PLT、CRP和ESR水平显著升高(P<0.01),而MPV与PDW明显下降(P<0.01,<0.05);尤其相比于cKD组,MPV与PDW水平在iKD组明显降低(P=0.003、0.014)。结论 提示川崎病患儿急性期MPV与PDW降低,尤其在不完全川崎病降低显著,故低水平的MPV与PDW可能对iKD的诊断有提示意义。     

MIRU-VNTR和Spoligotyping用于重庆地区210株儿童结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的 评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和基于结核分枝杆菌散在分布数目可变串联重复序列分析(MIRU-VNTR)方法在重庆地区儿童结核病分子流行病学中的应用.方法 收集重庆地区210株儿童结核分枝杆菌(MTB)临床分离株,应用上述两种分型方法进行比较分析.结果 采用Spoligotyping分型方法,210株菌可分为2个基因群44种基因型,其中最大的1个基因群即北京家族(北京基因型)含有130株菌(61.90%).采用MIRU-VNTR分析发现24个位点的多态性差异较大,不同MIRU位点组合(12、15和24位点)的分辨率指数依次升高,后两个组合的差异是由位点ETR-B引起.各位点和各位点组合在北京家族菌株中的分辨率指数均高于非北京家族菌株.结论 重庆地区儿童MTB具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族.在结核病原学监测中,可先采用Spoligotyping,再对成簇菌株进行15位点与ETR-B组合二次分型的联合分型策略,可提高分子流行病学调查效果.

Abstract：

Objective To evaluate the application of spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) and mycobaeterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat (MIRU-VNTR) analysis in the molecular-epidemiological study of tuberculosis and to discuss the characteristics of pediatric Mycobacterium (M.) tuberculosis strains in Chongqing. Methods M. tuberculosis strains isolated and typed by Spoligotyping and MIRU-VNTR respectively, from the children patients in Chongqing and to compare the results from both methods, epidemiologically. Results By means of Spoligotyping, 210 clinical isolates were divided into 2 gene groups, displaying 44 genotypes. Among them, the biggest group was M. tuberculosis Beijing family, including 130 strains (61.90%) ,using the Spoligotyping. From the results of MIRU-VNTR, 24 loci showed different polymorphism and the HGI of different loci set (12 old loci, 15 basic loci and 24-loci set) increased accordingly. The subtle difference in HGI was originated from one locus ETR-B, which was included in the 24-locus system. The diversity of each loci and MIRU-VNTR set for non-Beijing genotype strains was higher than that of the Beijing genotype strains. Conclusion In this study, it was preliminarily confirmed the existence of high polymorphism of M. tuberculosis while the Beijing Family was the main genotype and main prevalent strain in children of Chongqing area. Spoligotyping prior to 15-locus with ETR-B combination seemed more suitable for the massive epidemiological investigation of pediatric tuberculosis patients.     

应用抑制消减杂交技术构建耐多药结核杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库,进一步探索结核杆菌耐多药的分子机制。方法：以耐多药菌株cDNA为实验组（Tester）,敏感株cDNA为驱动组（Driver）应用抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridiza－tion,SSH）技术结合T/A克隆技术构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库。结果：成功构建了耐多药结核菌株差异表达消减cDNA文库,获得113个差异表达cDNA片段。结论：研究表明SSH技术是筛选新功能基因的有效方法;多种已知或未知基因均参与了结核杆菌耐多药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础。     

川崎病(KD)患者血清中抵抗素对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC) ET-1及NO/eNOS的作用

 目的  探讨抵抗素与川崎病(Kawasaki disease,KD)患儿冠状动脉内皮细胞ET-1及NO/eNOS的关系。方法  收集川崎病患儿和健康儿童血清,加入人冠状动脉内皮细胞培养体系,分为4组:KD患儿血清组(KD组)、抵抗素组(Re组)、正常人血清组(N组)、KD患儿血清加抵抗素抗体组(KD+antiRe组)。干预24 h后,硝酸酶还原法测定细胞上清液中NO水平,real-time PCR测定细胞ET-1及eNOS的mRNA表达,ELISA检测细胞上清抵抗素及eNOS蛋白的表达水平。结果  各组抵抗素水平:与N组比较,KD组与Re组抵抗素水平明显增高(P<0.05),KD+antiRe组抵抗素水平明显下降(P<0.05),KD组较Re组降低(P<0.05)。各组NO水平:与N组比较,KD组和KD+antiRe组NO水平明显升高(P<0.05),Re组下降(P<0.05);KD+antiRe组较KD组NO水平升高更明显(P<0.05)。各组ET-1mRNA表达水平:与N组及KD+antiRe组比较,KD组、Re组的ET-1 mRNA表达水平升高(P<0.05),N组与KD+antiRe组间差异无统计学意义,KD组与Re组间差异无统计学意义。各组eNOS mRNA及蛋白表达水平:KD组、Re组与KD+antiRe组较N组均降低(P<0.05),KD组较Re组及KD+antiRe组降低(P<0.05),Re组较KD+antiRe组降低(P<0.05)。结论  抵抗素参与了KD患儿冠状动脉内皮细胞损伤,其机制可能与调节ET-1及NO/eNOS表达有关。     

抵抗素调节人冠状动脉内皮细胞MMP-9表达机制探讨

目的：探讨抵抗素调节冠状动脉内皮细胞中基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）－9的表达及其机制。方法：用含1%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的DMEM/F12培养基培养人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAECs）16 h（血清饥饿培养）,之后随机分为6组：（1）空白对照（Con）组：无抵抗素干预;（2）Res20组：抵抗素20 ng/ml干预;（3）Res40组：抵抗素40 ng/ml干预;（4）Res100组：抵抗素100 ng/ml干预;（5）Res40+U0126组：细胞中加入细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）抑制剂U0126（20 mmol/L）预处理1 h,再加入抵抗素40 ng/ml干预;（6）U0126组：细胞中仅加入ERK抑制剂U0126（20 mmol/L）,细胞各组干预24 h后,用RT-PCR法检测MMP-9和蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP）－1 mRNA表达,ELISA法检测MMP-9和TIMP-1蛋白水平,Western blot检测HCAECs p-ERK1/2及ERK1/2的蛋白表达。结果：3种浓度抵抗素干预HCAECs 24 h后,MMP-9 mRNA与蛋白水平均较空白组明显升高（P＜0.05）;TIMP-1 mRNA与蛋白水平均较空白组明显降低（P＜0.05）。40 ng/ml抵抗素干预组加入ERK抑制剂U0126后,MMP-9 mRNA与蛋白水平明显下降（P＜0.05）,TIMP-1 mRNA与蛋白无明显变化。与Con组、U0126组及Res40+U0126组相比,Res40组p-ERK1/2蛋白表达明显增高（P＜0.05）。结论：抵抗素可诱导HCAECs MMP-9的生成,可能通过下调TIMP-1的表达及激活ERK通路参与这一过程。     

产褥期静脉血栓栓塞性疾病的诊断与处理

静脉血栓栓塞性疾病是产褥期妇女严重并发症之一。静脉血栓栓塞性疾病包括深静脉血栓形成及肺栓塞两种。由于该病有潜在致死性,因此早期诊断和规范治疗是改善孕产妇妊娠结局的关键。现就产褥期静脉血栓栓塞性疾病的形成机制、诊断及治疗作一阐述。