鼻疽诺卡菌感染小鼠足垫后组织病理变化以及细胞因子分泌情况的初步研究

目的 了解鼻疽诺卡菌感染动物模型小鼠足垫后不同时间的组织病理进展变化以及细胞因子分泌情况,为鼻疽诺卡菌致病机制研究提供依据。方法 应用对数生长期的鼻疽诺卡菌注射于小鼠足垫,建立感染模型。将感染1、3、7、14 d后小鼠分别脱臼处死,用手术刀片切取感染小鼠的足垫,制备切片,应用HE染色观察组织不同时间的病理变化,通过免疫组化研究感染过程中IL-6、IL-12、IFN-、TNF表达分泌情况。结果 通过HE染色观察到感染后第1天中性粒细胞浸润,炎症形成;感染后第3天中性粒细胞脓肿形成,进入急性感染时期;感染后第7天肌肉组织间大量肌纤维母细胞及血管内皮细胞增生,感染转入慢性感染时期;感染后第14天肌肉组织间大量肌纤维母细胞及血管内皮细胞增生,见局灶小脓肿,周围见片状增生的泡沫样巨噬细胞,进入感染修复期。组织免疫组化结果显示,在炎症形成时期,组织中的IL-6和TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）;在急性感染期,组织中仅可见TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）;在慢性感染期,组织中IL-6、IL-12、IFN-和TNF表达量均高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）;在感染修复期,组织中的IL-6、IFN-和TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）。结论 鼻疽诺卡菌感染小鼠足垫后出现明显的病理变化周期,在感染第3天开始进入急性感染时期,感染后第7天转入慢性感染时期,感染后第14天进入组织修复期,并且IL-6、IFN-、TNF参与了炎症反应,尤其是IL-6表达量最高,主要促进Th0向Th1和Th17亚群分化,激活巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞等,增强其吞噬和杀伤功能,以杀伤胞内鼻疽诺卡菌。     

生物安全培训问题分析及系统方法建立的研究

生物安全培训是有效的病原微生物实验室生物安全的保障手段之一,但随着生物安全管理不断深入,传统培训形式和内容已很难达到应有的培训效果。本研究通过对过去3年传统生物安全培训中存在问题的总结,借鉴国际标准化培训流程,从课程设置、培训形式、培训考核方式及持续改进等方面进行调整,在本单位建立一套系统的生物安全培训方法。经过一年的实施,大幅提高人员对培训的参与程度和生物安全培训效果。。     

布鲁氏菌104M液体气溶胶免疫BALB/c小鼠的有效性评价和安全性研究

目的 评价布鲁氏菌104M液体气溶胶肺递送途径免疫BALB/c小鼠有效性和安全性。方法 随机选取6～8周龄BALB/c雌鼠,分别经肺递送、滴鼻和皮下注射3种途径免疫接种布鲁氏菌104M,于免疫后第4、8、16、24周观察并记录小鼠的症状、检测小鼠体重、脾重、脾脏载菌量及肺匀浆、血清的抗体和细胞因子。待鼠脾脏载菌完全清除,用布鲁氏菌A19液体气溶胶肺递送途径攻毒。结果 各组实验小鼠均未见异常症状;体重无显著下降;攻毒前,脾重没有明显变化;攻毒后,免疫组小鼠脾重显著低于空白对照组（P<0.05）：液体气溶胶肺递送：实验组（0.26±0.16）g<空白对照组（0.40±0.19）g,滴鼻：实验组（0.21±0.11）g<空白对照组（0.28±0.19）g,皮下注射：实验组（0.14±0.02）g<空白对照组（0.30±0.18）g。随着免疫时间的增长,免疫组小鼠脾脏载菌量呈下降趋势,第20周完全清除。攻毒后2周（免疫24周）,所有小鼠脾脏载菌均显著增加,各免疫组脾载菌量均显著低于空白对照组（P<0.05）：脾载菌量以log₁₀菌落形成单位（colony-forming units,CFU）/g计数并统计分析,液体气溶胶肺递送：实验组（4.49±0.13）<空白对照组（6.90±0.46）;滴鼻：实验组（3.59±1.06）<空白对照组（7.08±0.14）;皮下注射：实验组（3.00±2.03）<空白对照组（6.81±0.34）。布鲁氏菌104M激发了BALB/c小鼠细胞免疫和体液免疫反应。在免疫后第4周,检测到104M特异性抗体IgG、IgM、IgA,第8周达到高峰,攻毒后再次显著上升。各免疫组血清和肺匀浆中IFN-γ和IL-18浓度在攻毒前,均显著高于空白对照组（P<0.05）,攻毒后,各免疫组血清IFN-γ和IL-18浓度均低于空白对照组（P<0.05）,而肺匀浆细胞因子浓度在攻毒前后均持续高于空白对照组（P<0.05）。结论 液体气溶胶肺递送途径是一种有效的免疫途径,表现出有效的保护作用;104M未引起小鼠体重减轻,相对安全,但在小鼠体内存活时间较长,引起小鼠轻度脾脏肿大,有一定的残余毒力。     

布鲁氏菌种及种内部分生物型快速PCR鉴定方法的建立及应用研究

目的 建立一步法PCR快速鉴定布鲁氏菌种及种内部分生物型.方法 设计6对引物,建立一步法PCR反应,将布鲁氏菌6个种和种内某些生物型进行鉴定,应用该方法检测了27株布鲁氏菌参考菌株和239株临床分离的布鲁氏菌,并与生物学分型方法进行比较.结果 通过一步法PCR能够将待检菌株准确的鉴定到布鲁氏菌种,对于猪种可以定位到生物型和疫苗株；对于牛种可以鉴定到牛种生物型1、3、4 与2、5、6、7、9两组生物型；对于羊种可以鉴定到1与2、3两组生物型和羊种疫苗株.生物学分型方法和PCR方法准确鉴定到种水平的符合率分别为98.33％和100％.结论 一步法PCR是一种快速、特异、简便而低费用的鉴定布鲁氏菌种的分子分型方法.     

病原微生物实验室生物安全标准体系框架研究

制定和实施病原微生物实验室生物安全标准是实现病原微生物实验室科学化、效率化、规范化管理和运行的重要手段。本文通过对国内外病原微生物实验室生物安全标准化建设的现状进行分析，提出病原微生物实验室生物安全标准体系框架，主要包含基础标准、管理标准、技术标准和行业应用4个部分，为病原微生物实验室生物安全标准化工作提供参考，助力我国生物安全事业的规范发展。     

53例诺卡菌感染病例临床特征分析

目的 探讨诺卡菌感染的临床表现、实验室检查、影像学特点及诊断、治疗、预后. 方法 检索1998-2013年国内医学数据库所报道的53例诺卡菌感染病例的相关文献并对其进行回顾性分析.以既往患病的诺卡菌病例为研究组,既往体健的诺卡菌病例为对照组,对比分析两组的临床表现,影像学特征及治疗转归情况. 结果 53例诺卡菌病例中,31例存在基础疾病.研究组与对照组临床表现除凹陷性水肿差异有统计学意义(2=4.442, P0.05),其他无统计学意义.药敏试验结果提示菌株对复方磺胺甲恶唑-甲氧苄啶(TMP-SMX)、阿米卡星、米诺环素等敏感.两组病例间死亡率的比较差异有统计学意义(2=4.576,P0.05). 结论 诺卡菌感染部位多见于肺,其临床特点无明显异质性,预后存在明显异质性,复方磺胺甲恶唑仍然是治疗诺卡菌感染的首选药物,临床上对于可疑病例应及早进行相关病原学检查.     

克隆、表达和纯化具有生物学活性的巴西诺卡菌P61蛋白

目的构建巴西诺卡菌P61基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中表达具有生物活性的P61蛋白,为P61蛋白的进一步相关研究提供实验基础。方法通过基因合成的方法合成P61基因,将其插入到质粒pET30a(+)载体并导入BL21大肠杆菌,应用IPTG进行诱导表达。通过Western Blot对表达产物进行分析。应用过氧化氢酶检测试剂盒检测其过氧化氢酶活性。结果 P61蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,且具有较高的过氧化氢酶活性,能被感染巴西诺卡菌的小鼠血清识别。结论成功构建了巴西诺卡菌P61蛋白的原核表达质粒,并能在原核表达宿主E.coli BL21中进行高效表达,且表达产物具有过氧化氢酶活性。     

非O157产志贺毒素大肠埃希菌分离株脉冲场凝胶电泳分析

目的 对国内不同宿主来源的非0157产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)分离株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析，以初步建立中国非0157 STEC菌株的基础数据库，了解其分子流行病学特征。方法 参照PulseNet非0157 STEC的PFGE实验方法对76株非0157 STEC分离株进行分析，并使用BioNumerics软件进行聚类。结果 在PulseNet推荐的电泳参数和内切酶XbaI情况下，菌株酶切片段分布均匀，条带易于识别。76株非0157 STEC分离株产生62种PFGE带型，初步聚类为A～M 13个群，不同来源菌株的PFGE带型分布广泛，但均具有某些优势的PFGE聚类群。结论 国内不同来源的非0157 STEC呈高度多态性，PulseNet推荐的PFGE电泳参数和内切酶XbaI适用于中国非0157 STEC菌株的分析。     

鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究

目的 通过鉴别鼻疽诺卡菌菌体蛋白中具有免疫原性的蛋白,为筛选鼻疽诺卡菌特异诊断抗原提供线索。方法 提取鼻疽诺卡菌菌体蛋白进行双向电泳,结合免疫印迹法筛选与抗鼻疽诺卡菌兔血清发生免疫反应的蛋白点。结果 在鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫杂交膜上,共发现9个具有抗原活性的蛋白,其中8个可在考马斯蓝染色胶上找到匹配点,通过介质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成功鉴定8个蛋白,全部定位于胞内。结论 本研究成功建立鼻疽诺卡菌免疫蛋白质组学方法,在鼻疽诺卡菌菌体蛋白中发现新的具有免疫原性的蛋白,可作为鼻疽诺卡菌特异性诊断候选抗原,用于诊断试剂的研究。