两家系强直性肌营养不良三核苷酸重复数检测与临床研究

我们对2例强直性肌营养不良症(ＤＭ)患者及家系成员的ＣＴＧ(胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘧啶)重复数检测,与临床表现、电生理检查作比较研究。现报道如下。资　　料临床资料　2例ＤＭ患者,按实用神经病学拟定的标准确诊[1]。对2例患者及家系25名成员进行详细的内科、眼科及神经系统检查,神经电生理检查肌强直电位、ＭＣＶ、ＳＣＶ、ＶＥＰ和心电图观察。两家系为非近亲婚姻、上海籍。家系2中12名检出4名患病者。家系1中13名成员临床检查皆正常。ＣＴＧ重复数测定　对两名患者及家系成员、1名正常对照者,分别抽出10ｍＬ静脉血置于肝素抗凝管摇匀。…     

白色念珠菌ERG11突变基因在毕氏酵母中的表达

目的 将含有点突变的白色念珠菌编码基因ERG11克隆至毕氏酵母中进行表达,判断其在白色念珠菌对氟康唑敏感性中的作用.方法 将含有点突变的白色念珠菌编码基因ERG11与pPIC3.5K载体重组,构建pPIC3.5K/Ca1.6k重组体,经Top10F'鉴定和筛选,电转入毕氏酵母GS115中,经过诱导表达出现目的 蛋白后,进行药物敏感性试验,确定点突变与耐药的关系.结果 含Y132H突变转化菌株和含Q474K突变的转化菌株对氟康唑的MIC分别上升16倍和8倍,证实其突变与耐药有关.结论 氟康唑耐药可发生于白色念珠菌编码基因ERG11的Y132H与Q474K点突变中.     

一种新的血管生成抑制因子-TSF的设计及表达

目的 选择PF4和TSP1的高活性片段设计融合基因－TSF，在大肠肝菌表达，细胞水平上检测表达产物的生物学活性。方法 PF4的C－末端13肽和TSP1的429－459片断31肽通过Gly-Pro-Gly肽桥设计为融合蛋白－TSF。采用pGEX-2T载体在E.coli JM109中表达TSF蛋白。采用MTT方法测定TSF及其相关性GST－TSF，PF4（58－70），TSP1（429－459）等对血管内皮细胞，平滑肌细胞，QGY7721人肝癌细胞，HLF人肺成纤维细胞等生长的抑制效应。结果 合成的TSF融合基因，克隆到pGEX-2T载体，转化E .coli JM109，获得了TSF蛋白的高效表达。建立了TSF蛋白的纯化复性方法，获得了GST－TSF融合蛋白及TSF蛋白。TSF，GST－TSF，PF4（58－70）和TSP1（429－59）均特异抑制血管内皮细胞的生长，其中TSF的活性最强，活性大小次序为TSF＞GST－TSF＞PF4（58－70）＞TSP1（429－459）。结论 融合表达蛋白－TSF在细胞水平上能高效特异抑制血管内皮细胞的生长。     

格特隐球菌vgⅡ基因型的快速鉴定和序列分型研究

目的 建立一种核糖体基因内间隔区(igs)的特异性pcr扩增和序列分析方法,用于快速鉴定格特隐球菌vgⅡ基因型及其亚型.方法 选取新型和格特隐球菌核糖体igs区中可变度最高的1区为靶点,经clustalx 2多重比对后,设计特异性扩增格特隐球菌vgⅡ基因型的引物用于pcr分析.通过扩增新型和格特隐球菌其余基因型以及其他致病酵母菌来评价引物的特异性,并对阳性扩增片段(vgⅡ基因型)进行测序和序列分型研究.结果 基于核糖体igs区的特异pcr引物扩增所有受试格特隐球菌vgⅡ基因型菌株均为阳性,而新型和格特隐球菌其余基因型以及其他致病酵母菌均为阴性.序列分型显示,在扩增片段的72、79和104 bp处存在3个多态性位点,可用于区分vgⅡ基因型中的不同亚型.结论 该研究建立的特异性pcr扩增方法可快速、准确地鉴定格特隐球菌vgⅡ基因型,对扩增片段的序列分型可初步筛查高致病性的vgⅡa亚型. abstract： objective to establish a pcr method for rapid identification and sequence typing of vg Ⅱ allele of the intergenic spacer region (igs) of cryptococcus gattii.methods since igs1 was of high sequence variation,multiple alignments were conducted by clustalx 2 in igs1 of cryptococcus gattii and cryptococcus neoformans,and then primer sets specific to genotype vg Ⅱ was designed for pcr analysis.the specificity of the primer pair was detected by amplification of the other genotypes in cryptococcus gattii,cryptococcus neoformans,and other pathogenic yeasts.the amplified fragments from vg Ⅱ genotype were sequenced and subtyped.results using the pcr analysis developed in this study,all vg Ⅱ genotype strains tested were amplified,whereas no amplification was obtained from other genotypes or yeast species involved herein.three polymorphic nucleotide sites at 72,79 and 104 bp in the fragment amplified could be used to distinguish sub-genotypes within vg Ⅱ genotype.conclusions the pcr analysis developed in this study can be used for rapid identification of genotype vg Ⅱ of cryptococcus gattii.the sequence typing based on the amplified fragment from igs1 may be performed for screening the highly virulent sub-genotype vgⅡ a.     

不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌的PCR-DGGE分析

目的 应用PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,分析不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌菌群及其菌种组成的多样性.方法 牙菌斑组织取自45例学龄前儿童,根据乳牙龋失补牙面(dmfs)指数分为无龋(dmfs=0)、中龋(dmfs=4～6)和高龋(dmfs＞8)(n=15).分别提取细菌总DNA,进行链球菌属rnp B特征序列的PCR扩增及DGGE分析,克隆、测序并与核酸序列数据库的序列进行比对.结果 无龋儿童菌斑中口腔链球菌菌群的基因型分布均显著高于中龋和高龋儿童(P＜0.05);变异链球菌群是高龋组中的优势菌群.结论 PCR-DGGE技术结合rnp B基因克隆文库分析可较灵敏、直观地反映牙菌斑中链球菌属各菌群及其菌种的组成情况.     

散发性帕金森病患者γ-synuclein基因的研究

目的 探讨γ-synuclein基因C243G和A377T多态在散发性帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的疾病易感性中的意义。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态法，对上海汉族人中145例PD患者和184名正常人进行γ-synuclein基因C243G和A377T多态分型，并作与PD的遗传关联研究。结果 PD患者与正常对照间γ-synuclein基因C243G和A377T多态分布的差异无显著性，两种多态与PD亦无关联(P值均大于0．05)。结论 上海地区汉族人群中γ-synuclein基因C243G和A377T多态与散发性PD无关。     

国内110株新生隐球菌临床株变种、基因型和交配型分析

目的 对国内部分地区的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)临床株进行分子流行病学调查,分析其变种、基因型和交配型的构成和分布.方法 (1)PCR指纹分型法:以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物对模板进行PCR扩增,将所有受试菌株鉴定到8种主要基因型水平.(2)利用变种和交配型特异性引物扩增分型法,区分格鲁比变种(C.neoformans var.grubii)、新生变种(C.neoformans var.neoformans)和格特变种(C.neoformans var.gattii),同时鉴定α和a交配型.结果 110株临床株中,98株(89.1%)为格鲁比变种,均为VNI基因型和α交配型;9株(8.2%)格特变种,包括VGⅠ基因型、α交配型8株(7.3%)和VGⅡ基因型、α交配型1株(0.9%);2株(1.8%)为AD杂合体,VNⅢ基因型,-/α和α/-交配型各1株;1株(0.9%)为新生变种,VNⅣ基因型和a交配型.结论 我国新生隐球菌临床株包含3个变种和AD杂合体.与国外情况比较,相似的是国内临床株中绝大部分为α交配型菌株,且格鲁比变种中的VNⅠ基因型占了其中的大部分;但未发现VNⅡ、VGⅢ和VGⅣ基因型菌株.     

含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌株的构建与鉴定

目的:构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261(减毒鼠伤寒沙门氏菌)疫苗菌.方法:将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入LB5000(鼠伤寒沙门氏菌)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测GFP(绿荧光蛋白)的表达和4-1BBL基因的转录.结果:导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930 bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同(P＞0.05).感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930 bp的目的条带.结论:成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌.     

CAP59荚膜相关基因最大外显子序列用于新生隐球菌分型的探讨

目的　探讨CAP5 9基因最大外显子序列对新生隐球菌进行分型的可行性。方法　根据CAP5 9基因最大外显子序列设计 1对引物 ,对新生隐球菌 5个血清型菌株进行PCR扩增和测序 ,用GenBank数据库分析序列的差别 ,Phylip3.6a3软件处理数据并绘制种系进化树 ,选择一定数量的新生隐球菌临床分离株和其他致病真菌进行临床验证。结果　新生隐球菌不同血清型菌株的CAP5 9最大外显子序列存在差别 ,临床验证显示CAP5 9基因最大外显子对受试菌株分型结果与免疫学分型结果全部符合。结论　以所设计引物扩增的基因可以作为新生隐球菌分型和检测的分子生物学工具。     

中国人COMT,DBH,DAT 和MAOB基因多态性与帕金森病易感性的关系

目的：探讨4种多巴胺递质代谢相关蛋白COMT，DBH，DAT和MAOB基因的多态性与上海地区居民帕金森病易感性的关系。方法：用聚合酶链反应和限制性长度片段多态性(PCR/RFLP)技术检测4种多巴胺能递质代谢相关蛋白基因多态性.对144名原发性帕金森病患者和188名年龄相匹配的健康人进行相关性分析。结果：与健康人相比，帕金森病患者DBH基因型或等位基因的分布不同，两组之间的差异有统计学意义(DBH等位基因：χ2=6．202，df=1，P=0．013，A2／A2基因型：OR=2．086，95％CI：1．225～3．552)；其余3个基因的结果如下：COMT Metl08Val多态性(等位基因：χ2=0．035，df=1，P=0．852；基因型χ2=1．546，dr=2，P=0．462)；DAT基因40bp可变数目串联重复多态性(等位基因：χ2=4．091，df=3，P=0．25；基因型：χ2=7．173，df=6，P=0．31)；MA0B(GT)n重复序列多态性(χ2=14．799，df=9，P=0．097)。结论：DBH基因多态性在中国汉族人帕金森病的易感性中可能起作用。