重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA的构建、鉴定及其对人脐静脉内皮细胞增生的影响

背景 脉络膜新生血管(CNV)是多种眼部疾病致盲的原因之一,研究发现补体系统在CNV的发病机制中起重要作用.目的 构建针对补体因子B(CFB)的小干扰RNA(siRNA)重组质粒,体外观察其对人脐静脉内皮细胞ECV-304增生的影响.方法 根据人CFB的基因序列设计引物,经PCR扩增后与质粒pRNAT-U6.1连接,得到重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA,并进行测序鉴定和PCR鉴定.ECV-304细胞株进行常规培养,用电转染技术将重组质粒或空质粒分别转染人ECV-304细胞株,分为CFB-siRNA转染组和空质粒转染组,未转染的细胞为空白对照组.细胞转染后继续培养48 h,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并计算转染效率;采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)法测定各组细胞中CFB mRNA的相对表达量;用MTT法检测各组细胞转染24、48和72 h时细胞的增生值(A)并计算生长抑制率;利用流式细胞技术检测各组细胞的生长周期变化.结果 PCR扩增的目的片段序列与CFB基因序列完全相符,ECV-304细胞转染后,倒置荧光显微镜下可见CFB-siRNA转染组和空质粒转染组的细胞中GFP呈绿色荧光.半定量RT-PCR结果显示,CFB-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组的CFB mRNA相对表达量分别为0.07±0.04、0.14±0.02和0.14 ±0.03,总体比较差异有统计学意义(F=233.05,P=0.00);其中CFB-siRNA转染组CFB mRNA相对表达量明显低于空质粒转染组和空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).MTT法检测结果显示,各组不同时间细胞增生抑制率总体比较差异有统计学意义(F分组=212.99,P=0.00);CFB-siRNA转染组细胞转染24、48、72 h后细胞增生的抑制率分别为(23.45±0.01)％、(33.48±0.02)％和(45.49±0.01)％,明显高于同时间点空质粒转染组和空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,CFB-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组G1期的细胞数占总细胞数的(44.4±0.5)％、(25.8±0.4)％和(27.9±0.6)％,总体比较差异有统计学意义(F=58.98,P=0.00);CFB-siRNA转染组G1期和G2期细胞所占百分比显著高于空白对照组和空质粒转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA可通过将细胞阻滞在G1期而有效抑制人脐静脉内皮细胞的增生.     

姜黄素上调线粒体融合蛋白2抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡的实验研究

目的 研究姜黄素抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡的作用与机制.方法 取45只清洁级BALB/c雄性小鼠,随机(随机数字法)分为3组,即假手术组(n=15),脓毒症组(n=15),姜黄素组(n=15),实验重复3次.脓毒症组行盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP),术前予等体积生理盐水灌胃1周;姜黄素组行CLP术,术前给予姜黄素200 mg/ (kg-d)灌胃1周;假手术组仅行开腹,不予以结扎、穿孔,术前等体积生理盐水灌胃1周.观察各组小鼠术后24h病死率,并处死存活小鼠,分离脾脏淋巴细胞.采用流式细胞术、TUNEL法检测淋巴细胞凋亡情况;流式细胞术检测线粒体膜电位水平;Western Blot检测线粒体融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)、Bax、Bcl-2蛋白表达.数据采用SPSS 18.0软件进行分析,计数资料采用x2检验,计量资料组间比较采用单因素方差分析.结果 小鼠病死率采用x2检验,脓毒症组小鼠术后24h病死率为46.7％,较假手术组0.00％明显升高(x2 =27.391,P＜0.01),姜黄素组病死率较脓毒症组有所降低(40.0％ vs.46.7％,x2=6.429,P=0.01).脾淋巴细胞凋亡率比较采用单因素方差分析,3组比较,P＜0.01,差异具有统计学意义.进一步两两比较,脓毒症组脾淋巴细胞凋亡率为(17.1±1.67)％,较假手术组(9.43±1.06)％明显增高(P ＜0.001);姜黄素组淋巴细胞凋亡率(12.70±1.25)％较脓毒症组比较明显下降(P=0.012).脾淋巴细胞线粒体膜电位比较采用单因素方差分析,3组比较P＜0.01,差异具有统计学意义.进一步两两比较,脓毒症组线粒体膜电位降低率为(45.13±4.14)％,较假手术组(21.63±1.62)％明显升高(P＜0.01),姜黄素组线粒体膜电位降低率为(29.67±2.15)％,较脓毒症组明显降低(P=0.001).蛋白表达情况采用单因素方差分析,3组线粒体Bax蛋白(P＜0.01)、胞浆Bax蛋白(P＜0.01),差异具有统计学意义.进一步两两比较,与假手术组比较,脓毒症组线粒体Bax蛋白表达水平明显上调(P=0.001),而胞浆Bax蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).经姜黄素预处理后线粒体Bax蛋白水平较脓毒症组明显降低(P=0.02),胞浆Bax蛋白表达水平明显升高(P＜0.01).3组细胞总Mfn2蛋白(P ＜0.001)、Bcl-2蛋白(P=0.001),差异具有统计学意义.进一步两两比较,与假手术组比较,脓毒症组Mfn2蛋白(P=0.015)、Bcl-2蛋白(P=0.01)表达水平明显降低,经姜黄素预处理后Mfn2蛋白(P=0.002)、Bcl-2蛋白(P =0.001)水平明显上调.结论 姜黄素能够上调Mfn2表达,促进线粒体融合进而抑制脓毒症小鼠脾淋巴细胞的凋亡.     

环扎加压术对于术前无黄斑区病变患者的影响

目的 观察环扎加压术对于术前黄斑区无病变患者的影响.方法 对53例53只眼视网膜脱离并且术前黄斑区无病变的患者接受环扎加压术.主要检查矫正视力和黄斑区OCT,Amsler表.结果 发现术后黄斑区存在病变的患者视物变形的发生率与术后黄斑区无病变的患者视物变形的发生率比较,差异有统计学意义(P＜0.005).结论 患者环扎加压术后黄斑区出现病变与术后出现视物变形存在密切关系.     

绷带镜治疗糖尿病患者玻璃体切割术后角膜上皮缺损的临床观察

目的分析糖尿病患者玻璃体切除术后角膜上皮缺损的临床特征,观察绷带镜治疗这类并发症的疗效。方法收集糖尿病患者行玻璃体切除术后角膜上皮缺损的病例共36例,均采用绷带镜进行治疗。结果36例患者均在接受绷带镜治疗后的不同时间内症状得到缓解,角膜上皮愈合,视觉质量提高。结论绷带镜可有效治疗糖尿病患者玻璃体切除术后角膜上皮的缺损,提高患者视觉质量。     

超声乳化手术中晶状体后囊破裂的处理

目的 评价白内障行超声乳化手术中晶状体后囊破裂的处理方法.方法 547例(634眼)白内障进行超声乳化手术中发生后囊破裂的13眼(2.05％),根据其后囊破裂发生的不同时段、是否有核块坠入玻璃体等情况,采取不同的处理方法.结果 13眼术后3个月最佳矫正视力均≥0.5,其中2眼于白内障手术后3周行玻璃体切除手术.结论 超声乳化术中晶状体后囊破裂后应积极处理,恰当有效的处理方法不但可以消除后囊破裂所致并发症,而且还能获得较好的视力.     

重组B因子小干扰RNA对激光诱导大鼠脉络膜新生血管的抑制作用

目的　探讨重组B因子（CFB）小干扰RNA(siRNA)抑制激光诱导的大鼠脉络膜新生血管(CNV)的效果。方法　采用基因重组的方法获得重组CFB siRNA,取棕色挪威（BN）大鼠42 只84 只眼,用激光光凝方式建立CNV模型,随机分为尾静脉注射组、玻璃体腔注射组、视网膜下腔注射组、对照组。3种不同的注射方式组分别设有相应的空质粒注射组。除对照组外,其余各组于激光光凝后第1、3、5天分别进行注射CFBsiRNA,尾静脉、玻璃体腔、视网膜下腔注射组的注射剂量分别为50、20、10 μg;对照组激光光凝后不给于任何干预。激光光凝前和光凝后14 d分别行荧光素眼底血管造影(FFA),根据荧光渗漏程度对各激光光斑评分来检测CNV的生成情况;免疫组织化学法检测各组大鼠脉络膜内血管内皮生长因子(VEGF)、第Ⅷ因子的表达情况。结果 各组激光光斑荧光渗漏程度评分结果显示,CFB-siRNA尾静脉注射组与对照组相比荧光渗漏程度明显减轻 (χ2=15.1620,P<0.05)。免疫组织化学结果显示,CFB-siRNA尾静脉注射组VEGF、第Ⅷ因子的阳性表达强度在激光光凝后不同时间点之间差异无统计学意义(F=20.35,18.33;P>0.05),而与同时间点其他各组相比,明显降低(F=77.96,55.68;P<0.05)。其他各组VEGF、第Ⅷ因子的阳性表达强度在激光光凝后14 d均显著强于激光光凝后7 d (F=60.89,61.12;P<0.05)。结论 通过下调VEGF及第Ⅷ因子的表达水平,重组CFB-siRNA能有效的抑制CNV的生成。     

学龄前儿童视力及Spot筛查仪屈光筛查结果分析

目的：了解学龄前儿童视力状况及Spot筛查仪在屈光筛查中的应用价值。方法：横断面调查研究。 对北京市海淀区5 866例3～6岁儿童进行视力检查及自然状态下Spot屈光筛查。对视力状况进行似 然比卡方检验。对视力正常儿童的屈光度采用Kruskal-Wallis H检验进行不同年龄组间差异比较，再 用Wilcoxon秩和检验进行组间两两比较。用M（Q1，Q3）描述各屈光度及屈光参差的分布特征，以 百分位数法得到屈光筛查的界值点。结果：按2种视力判定方法得到3～6岁儿童视力低常率分别为 4.25%和17.29%。不同年龄组间的差异均有统计学意义（P<0.05）。视力正常儿童的球镜度、柱镜度 和双眼球镜度参差在不同年龄组间的差异均有统计学意义（P<0.05）。随年龄增长，远视度降低，散 光度降低。等效球镜度（SE）、双眼柱镜度参差和SE参差在不同年龄组间的差异均无统计学意义。 球镜度和SE的P2.5、P97.5分别为0 D、+1.50 D和-0.25 D、+1.00 D。柱镜度的P5为-1.25 D。球镜度 参差和柱镜度参差的P95均为0.75 D。结论：Spot筛查仪屈光筛查数值获取率高，在大规模人群筛查 工作中有一定应用价值，可参考各界值点结合视力等情况给予转诊。     

青光眼白内障联合手术治疗急性闭角型青光眼

目的观察晶状体超声乳化吸出、人工晶状体植入联合小梁切除术治疗急性闭角型青光眼的疗效。方法急性闭角型青光眼39例（46只眼），进行巩膜瓣下隧道切口行晶状体超声乳化吸出、后房型人工晶状体植入联合小梁切除术。随访1个月～1年，对比术前、术后的视力，前房深度和眼压变化。结果46眼最佳矫正视力较手术前提升，术后眼压波动于正常范围，前房深度较术前增加。术后出现角膜水肿39眼，虹膜反应和晶状体前膜11眼，经积极治疗后明显改善。结论青光眼白内障联合手术疗效确切，虽然也存在一定的并发症，但及时处理并发症，仍可获得良好疗效。     

Klotho与自噬在脓毒症急性肾损伤小鼠中的表达趋势北大核心CSCD

目的研究脓毒症急性肾损伤小鼠中Klotho与自噬的关系。方法选用清洁级健康雄性Balb／c小鼠,用盲肠结扎穿刺术（cecalligationandpuncture,CLP）建立小鼠脓毒症急性肾损伤模型,分别在CLP造模后3h、6h、12h、1d、2d、3d、5d处死小鼠（n=12只）;假手术组（Sham）（n=6）1d处死,正常组（Normal）（n=6）同时处死。留取血清检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）,肾组织行HE和PAS染色,观察光镜病理结果,电镜超微结构观察自噬体的形成,Westernblot和免疫组化检测肾组织Klotho蛋白、LC3蛋白和P62蛋白的表达以及分布。SPSS23．0软件采用独立样本资料的t检验进行统计学分析。结果CLP术后Scr和BUN明显升高,1d时达高峰,分别为（165．64±20．56）~mol／L和（45．51±d．05）mmol／L;HE和PAS染色显示肾小管刷状缘上皮细胞脱落,基底膜暴露,间质炎症细胞浸润,电镜显示肾脏可见自噬小体和吞噬泡。与Sham组相比,Klotho蛋白浓度从3h开始逐渐变淡,至1d时达最低值（t=51．851,P〈0．01）,2d时有所恢复,然后逐渐转浓;LC3-Ⅱ呈相反的变化趋势,从3h开始逐渐增浓,至1d时达峰值（t=-22．676,P〈0．01）,2d时有所下降,然后逐渐变淡,而P62（t=6．43,P=0．002）作为自噬的相关蛋白与LC3-Ⅱ反应相反,表明自噬的激活作用,在1d这个时间点最显著。免疫组化显示Klotho蛋白和LC3-II蛋白主要分布于肾小管胞浆内。CLP术后1d,Klohto蛋白明显减弱（t=-8．371,P〈0．01）,LC3-Ⅱ蛋白明显增浓（t=4．995,P=0．001）。结论脓毒症急性肾损伤是Klotho减少,自噬增强的一个过程,Klotho和自噬的表达具有一定的时间依赖性。     

内源性眼内炎1例

资料患者女性,66岁。因"左眼眼睑肿胀不能睁眼伴视力丧失3 d"入院。入院6 d前患者在急诊诊断为"急性胃肠炎、发热",给予全身抗生素治疗;3 d前在急诊诊断为"泌尿系统感染",继续给予抗生素静脉滴注治疗。同时自觉左眼视力下降伴眼睑高度肿胀来我科就诊。查体:左眼无光感,左眼睑高度肿胀,眶压高,不能睁眼,左眼结膜高度水肿,角膜雾状混浊,前房浅,房闪(++),瞳孔区可见一团白色渗出膜,余组织