应用细菌人工染色体技术体外繁殖人巨细胞病毒

目的体外快速繁殖人巨细胞病毒（ HCMV）。方法用试剂盒抽提、纯化重组HCMV细菌人工染色体（BAC）,以重组HCMV细菌人工染色体（BAC-HCMV）为模板扩增UL82基因,酶切后连接至pcDNA载体,构建pcDNA-pp71重组质粒,转化感受态宿主菌,抽提及鉴定重组质粒。通过电穿孔技术将BAC-HCMV与鉴定成功的pcDNA-pp71重组质粒共转染人包皮成纤维细胞,通过多重PCR法及观察细胞病变效应、绿色荧光蛋白等方法鉴定培养后获得的HCMV。结果（1）获得pcDNA-pp71重组质粒,经PCR及双酶切后,片段大小与预期相符,进一步测序鉴定成功。（2） BAC-HCMV与pcDNA-pp71共转染人包皮成纤维细胞,出现细胞病变效应,经荧光显微镜观察可见绿色荧光。（3）以培养出的病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,获得两条与预期大小相符的条带,鉴定HCMV体外繁殖成功。结论应用BAC技术成功在体外快速繁殖HC-MV,为HCMV研究提供实验材料,也为进一步研究HCMV分子机制奠定基础。     

轻度持续性支气管哮喘患儿单用孟鲁司特的疗效

目的评估在实际生活条件影响下轻度持续性支气管哮喘(哮喘)患儿单独使用孟鲁司特进行控制治疗的效果。方法选取2～14岁在社区进行治疗的轻度持续哮喘患儿,进行前瞻性、单组、非盲观察性研究。孟鲁司特每天1次,2～5岁年龄组每次4 mg,6～14岁年龄组每次5 mg,持续12周,患儿通过监护人员给药,采取门诊复诊、随访的方式进行治疗及评估。分别在研究的0、4、8、12周,对过去7 d的日间症状、夜间症状进行严重程度评分,对峰值流速(PEF)、短效β2受体激动剂使用量进行检测和记录。采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。结果 2个年龄组日间症状、夜间症状严重程度评分在各随访时间点的评分逐步降低,各相邻时间点均数差异有统计学意义(P<0.05);短期使用短效β2受体激动剂的量明显下降,从第0周到第4周观察到显著的减少量(P<0.05);PEF不断改善,终点观察值(第12周)与起始值(第0周)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论对轻度持续哮喘患儿在社区实际生活条件影响下单用孟鲁司特仍可以有效控制哮喘症状的发作。     

智力发育迟缓患儿染色体亚端粒区研究

目的 联合应用多重连接依赖探针扩增技术(muhiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对不明原因智力发育迟缓(mental retardation,MR)患儿进行病因学研究,探讨本地区MR患儿亚端粒区异常与表型的关系.方法 将2009年7月至2011年12月在广东省妇幼保健院就诊的原因不明的67例MR患儿纳入研究,采集患儿及其父母外周血,提取基因组DNA,通过MLPA筛查,检测亚端粒区异常情况,用2种MLPA试剂盒(P070和P036)进行相互验证,异常者进一步分析其父母染色体亚端粒区情况,确定是否新发;根据检测结果与临床表现,分析染色体亚端粒区重排与临床表型的相关性.结果 67例MR患儿纳入研究,男42例,女25例;年龄6个月～15岁;IQ 20～ 70分,轻度MR(IQ≥50分)47例,中重度MR(IQ＜ 50分)20例;7例有抽搐史,体表畸形24例,脏器畸形18例.经MLPA检测发现4例亚端粒拷贝数异常,检出率5.97％,4例均为新发病例.亚端粒异常阳性和阴性患儿的性别比例、年龄、是否有抽搐病史等进行比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05).中重度MR患儿亚端粒异常比例(20.0％)较轻度高;阳性患儿在生长发育、体格畸形及脏器畸形等方面的异常比例均较阴性患儿高,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 染色体亚端粒区异常可能是不明原因MR的重要病因之一;原因不明智力低下者,应对其亚端粒区进行检测,为寻找可能的病因提供线索,为遗传咨询提供依据.     

应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究CSCD

目的 研究人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）临床病毒株UL/b＆#39;区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列（External guide sequences,EGS）在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.     

人巨细胞病毒临床分离株的鉴定及UL148基因分析

目的:研究广州地区先天性感染患儿体内人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株的鉴定及其UL148基因的序列特征分析。方法:收集广州地区感染HCMV的新生儿尿液标本,从中分离低传代临床病毒株,应用多重PCR方法鉴定,对其进行UL148基因全序列扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果:成功分离出3株HCMV低传代病毒株(D2、D3、D52),经鉴定后的UL148基因序列被GenBank收录,序列号为:DQ180380,DQ180363和DQ180354。序列分析显示,3株临床分离株中UL148序列高度保守;在UL148全基因序列951个核苷酸中,所有变异均为碱基替换,无插入及缺失突变;编码蛋白由316个氨基酸残基组成,氨基酸序列也比较保守,各分离株中变异率为0.3%～1.9%;编码蛋白翻译后修饰位点包括细胞黏附相关的特征序列、PKC磷酸化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点等;其编码蛋白等电点为9.17～9.37。结论:广州地区HCMV UL148基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列极为保守,但仍具有一定的多态性,提示UL148 ORF可能是一个重要的功能基因。     

完整睡眠周期视频脑电图在儿童发作性疾病诊断中的价值

目的:探讨完整睡眠周期视频脑电图在儿童发作性疾病诊断中的价值。方法:对719例具有发作性症状的儿童进行包括清醒及完整睡眠周期的视频脑电图监测。结果:719例患儿平均记录2.8h。其中318例(44.2%)记录到临床事件,其中198例(27.5%)伴同步癫癎性放电。401例(55.5%)在监测中无发作,但288例(40.1%)有脑电异常。总异常率67.7%。结论:完整睡眠周期视频脑电图提高了检查阳性率,对儿童发作性疾病具有重要的诊断价值。     

IL-6基因634C/G多态性与糖尿病周围神经病变相关性研究

目的：探讨白细胞介素-6(IL-6)基因启动子区-634C/G多态性与广东地区汉族人群糖尿病周围神经病变(DPN)的关系。方法收集2014年1月至2015年1月我院收治的125例2型糖尿病无周围神经病变患者(DPN0组),83例2型糖尿病周围神经病变患者(DPN组)及101例健康对照者(NC组),采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测其IL-6基因启动子区-634C/G多态性,比较分析各组间基因型频率、等位基因频率以及相关临床资料。结果 DPN0组的GG基因型频率(16.0%)明显高于NC组的4.0%(P<0.05),DPN0组(34.4%)、DPN组(33.1%)的G等位基因频率均明显高于NC组的22.3%(P<0.05),但DPN0和DPN两组间G等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-6基因启动子区-634 G/G基因型不是广东汉族人群DPN发生的遗传危险因素,但G等位基因可能是DPN发生的遗传危险因素之一。     

多重PCR方法鉴定人巨细胞病毒临床病毒分离株

目的:应用多重PCR技术鉴定体外培养、分离获得的人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株.方法:以先天性感染HCMV的新生儿为研究对象,采集尿液标本进行病毒分离,将分离获得的临床低传代病毒感染HELF细胞,提取病毒DNA,针对较保守基因IE和LA,设计两对引物,同时扩增IE和LA基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析.结果:成功分离获得2株HCMV临床低传代病毒株(D2、D3),经多重PCR同时扩增出209 bp(IE)和401 bp(LA)目的片段.结论:多重PCR可以作为病毒分离后,基础研究中鉴定HCMV临床病毒株的一种方法.     

广州地区人巨细胞病毒临床低传代株UL136基因的序列特征及多态性

目的 研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代株UL136基因的序列特征与基因多态性.方法 从10例广州感染新生儿体内分离获得2株(D2、D3)临床HCMV分离株,经多重PCR鉴定后进行UL136基因全序列扩增.PCR产物纯化后进行基因克隆,构建HCMV UL136-pMD18-T重组质粒.经基因测序及应用生物信息学分析方法 ,分析其核酸序列稳定性、编码蛋白质的二级结构与特征.结果 成功分离2株HCMV临床分离株,测序结果 显示,D2、D3及与GenBank中公布的11株临床分离株(4J、51C、39J、33J、63J、22M、10J、32C、29C、27C、Toledo)中,UL136序列高度保守.同源性分析显示在UL136全基因序列1019个核苷酸中,存在30个位点变异,所有的变异均为碱基替换,无插入及缺失突变.编码蛋白的氨基酸序列也高度保守,240个氨基酸残基中,不同临床分离株氨基酸变异率为1.6%～3.7%.不同分离株的UL136蛋白中参与形成二级结构的氨基酸数目及等电点不同.进化树分析结果 显示D2和D3均属于1a群.结论 广州地区临床低传代分离株HCMV UL136基因核苷酸序列及其氨基酸序列极为保守,但仍存在一定多态性.其基因的稳定性提示HCMV UL136开放阅读框(ORF)可能是一个具有重要功能的基因.其编码后修饰位点提示UL136可能与膜受体介导的细胞信号转导通路有关.     

CD8~+CD28~+/CD8~+CD28~-T细胞在过敏性鼻炎患儿外周血中的表达

目的分析过敏性鼻炎患儿外周血中CD8+CD28+/CD8+CD28-T细胞的表达情况,探讨其在过敏性鼻炎发病中的意义。方法选取诊断为过敏性鼻炎的患儿36例(过敏性鼻炎组),同期体检的健康儿童30例作为对照组,分别采用流式细胞技术检测外周血中CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD28+T淋巴细胞亚群的表达情况,分析其相关性。结果过敏性鼻炎组CD8+CD28+T细胞百分比为(20.2±4.4)%,高于对照组的(18.9±3.6)%;过敏性鼻炎组CD8+CD28-T细胞百分比为(6.2±2.3)%,低于对照组的(8.3±2.3)%;过敏性鼻炎组CD28+T细胞百分比为(66.3±9.6)%,高于对照组的(45.6±4.1)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。而CD8+T细胞的百分比两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CD8+CD28+T细胞在过敏性鼻炎患儿外周血中增生活跃,CD8+CD28-T细胞相应降低,而总CD8 T细胞百分比维持相对稳定或稍低,提示CD8+CD28+与CD8+CD28-T细胞亚群的失衡参与了过敏性鼻炎的病理过程。