反射性共聚焦显微镜对早期蕈样肉芽肿定位诊断与疗效监测的研究

【摘要】 目的 分析早期蕈样肉芽肿（MF）皮损的反射性共聚焦显微镜（RCM）与组织病理学特征的一致性,探讨RCM作为病理学诊断早期MF的辅助价值及动态监测治疗反应的可行性。方法 2014年1月至2018年1月在杭州市第三人民医院皮肤科门诊收集临床疑诊MF病例40例,男26例,女14例,年龄（47.0 ± 17.6）岁。根据总结的早期MF的RCM特征,对活检部位进行初步定位后行组织病理学检查,对比MF的RCM与病理特征。对MF确诊病例进行窄谱中波紫外线联合干扰素治疗,运用RCM对靶向皮损跟踪随访,9个月后评价疗效。结果 在40例临床疑诊MF病例中,根据RCM特征初步诊断典型MF 8例,疑似MF18例,排除14例;根据MF病理学特征诊断典型MF12例,疑似14例,排除14例。一致性分析显示,RCM特征分类与病理诊断结果的Kappa系数为0.848,P < 0.01。RCM与组织病理学特征之间表皮低折光细胞浸润的相关性最高（Kappa系数 = 1,P = 0.005）,其次是红斑期的真皮纤维化（Kappa系数 = 0.714,P = 0.035）。MF的RCM特征随着治疗的进行逐步恢复正常,但直至临床皮损完全缓解,非典型淋巴细胞依然存在。结论 RCM技术可用于早期疑诊MF皮损的病理取材定位,同时可尝试作为一种动态监测MF疗效的方法。     

Th17和Treg细胞与蕈样肉芽肿相关性研究

目的 探讨调节性T（Treg）细胞和Th17细胞在蕈样肉芽肿不同分期中的变化。 方法 流式细胞仪检测28例蕈样肉芽肿、13例大斑块型副银屑病、17例扁平苔藓患者及10例健康对照外周血Treg细胞和Th17细胞百分率,同时应用免疫组化法检测40例蕈样肉芽肿、13例副银屑病、17例扁平苔藓及10例健康对照蜡块组织中叉头状转录因子P3（FOXP3）和白细胞介素17（IL-17）的表达。 结果 蕈样肉芽肿、副银屑病、扁平苔藓患者外周血Treg细胞百分率分别为（8.09 ± 1.68）%,（6.53 ± 1.67）%,（2.84 ± 1.16）%较健康对照［（1.01 ± 0.35）%］升高,差异均有统计学意义。蕈样肉芽肿、副银屑病患者外周血Treg细胞百分率亦高于扁平苔藓（均P < 0.05）;蕈样肉芽肿与副银屑病患者差异无统计学意义（P > 0.05）。外周血Th17细胞百分率在蕈样肉芽肿较副银屑病、扁平苔藓患者比健康人升高［（3.22 ± 0.82）%比（2.46 ± 0.79）%,（1.38 ± 0.47）%和（0.59 ± 0.30）%,均P < 0.05］。FOXP3阳性率在蕈样肉芽肿、副银屑病及扁平苔藓均高于正常皮肤组织［（14.94 ± 4.46）%,（11.95 ± 4.72）%,（6.32 ± 2.81）%比（3.43 ± 1.79）%,均P < 0.05］,蕈样肉芽肿及副银屑病比扁平苔藓高（均P < 0.05）,蕈样肉芽肿比副银屑病差异无统计学意义（P > 0.05）。IL-17阳性率在蕈样肉芽肿、副银屑病、扁平苔藓和正常组织中分别为（15.89 ± 4.27）%,（12.02 ± 3.34）%,（4.84 ± 1.93）%和（2.62 ± 0.89）%,其中,蕈样肉芽肿均高于副银屑病、扁平苔藓组织及正常组织（均P < 0.05）。蕈样肉芽肿、副银屑病外周血Th17/Treg细胞比率比扁平苔藓、健康对照低（0.41 ± 0.11,0.39 ± 0.12比0.50 ± 0.06,0.57 ± 0.19（均P < 0.05）。早期蕈样肉芽肿Th17细胞与Treg细胞呈正相关（r = 0.423,P < 0.05）,肿瘤期蕈样肉芽肿Th17细胞有所下降,而Treg细胞继续升高,但蕈样肉芽肿各期差异无统计学意义,且二者在肿瘤期无相关性。 结论 Treg和Th17细胞失衡可能参与了蕈样肉芽肿的发生与发展。     

蕈样肉芽肿在反射式共聚焦显微镜下的特征

目的 探讨临床上皮损表现为红斑鳞屑的蕈样肉芽肿在反射式共聚焦显微镜(RCM)下的特征.方法 2011年6月至2012年5月皮肤科门诊的收集蕈样肉芽肿患者6例,年龄7～73岁,病程1～5年;男4例,女2例;斑片期2例,斑块期3例,肿瘤期1例.均经组织病理和免疫组化及相关检查确诊.RCM观察6例蕈样肉芽肿患者各3处皮损,选取1处皮损行组织病理检查.结果 发现角化过度,棘层混乱,基底层色素环折光减弱,表皮内可见散在分布的单个圆形或类圆形的高折光细胞,真皮乳头环内可见少许炎细胞浸润.少数可见低折光的,圆形至椭圆形的细胞聚集形成的一个囊泡样结构.这些RCM特征与其组织病理对照有较好的一致性.结论 结合临床表现,RCM可能作为蕈样肉芽肿的无创性辅助诊断方法.     

p53基因沉默对HaCaT细胞MicroRNA表达谱的影响

目的 研究p53基因沉默前后HaCaT细胞microRNA（miRNA）的差异表达谱并进行相关功能分析。方法 利用慢病毒介导的RNAi对培养的HaCaT细胞株进行p53基因沉默,通过Trizol法抽提细胞总RNA,PEG（聚乙二醇）方法分离miRNA,T4RNA连接酶荧光标记后进行miRNA芯片杂交,利用Genepix 4000B 图像分析软件和Genepix Pro 6.0软件进行数据分析,生物信息学方法检索出p53基因沉默前后HaCaT细胞差异表达的miRNA调控的靶基因,选取每个miRNA调控的前20个靶基因进行靶基因功能及KEGG分析。结果 p53基因沉默前后HaCaT细胞中发现53个差异表达的miRNA,其中41个表达上调,12个下调（差异 ＞ 2倍）。上调超过200倍的miRNA有：hsa-miR-141-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-19a-3p;下调超过75%的miRNA有：hiv1-miR-TAR-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1275。靶基因预测和靶基因KEGG分析结果显示,部分靶基因与MAPK信号通路、代谢通路、肿瘤侵袭等有关。结论 hsa-miR-141-3p等9个miRNA及其调控的靶基因可能参与p53的分子调控。 【关键词】 基因,p53; 角蛋白细胞; 微RNAs; 基因沉默; 芯片分析技术     

长脉宽1 064 nm激光联合盐酸阿莫罗芬治疗甲真菌病疗效观察

摘 要 目的：观察长脉宽1 064 nm激光联合5%盐酸阿莫罗芬搽剂治疗甲真菌病的临床疗效。方法: 甲真菌病患者106例随机分为观察组与对照组各53例。对照组采用5%盐酸阿莫罗芬搽剂治疗,观察组在对照组基础上结合长脉宽1 064 nm激光治疗。两组疗程均为6个月。比较两组患者治疗疗效、病区甲板长度和健区甲板长度、真菌清除情况及药品不良反应。结果: 观察组总有效率为90.57%,真菌清除率为86.79%,两项指标均高于对照组（75.47％和67.92％,P＜0.05）。治疗后,两组患者病区甲板长度明显减少,健区甲板长度明显增加（P＜0.05）;且观察组患者病区甲板长度和健区甲板长度均优于对照组患者（P＜0.05）。两组均未见药品不良反应发生。结论:长脉宽1 064 nm激光联合5%盐酸阿莫罗芬搽剂治疗甲真菌病临床效果显著,安全可靠,具有重要研究价值。     

蕈样肉芽肿白细胞介素13及其受体表达

目的 探讨白细胞介素13(IL-13)及其受体在蕈样肉芽肿(MF)皮损中的表达及临床意义.方法 2010年1月至2016年3月收集杭州市第三人民医院皮肤科经临床、病理、免疫表型和(或)T细胞受体基因重排检测确诊的MF石蜡组织标本34份,IA期5例,IB期9例,ⅡA期17例和ⅡB期3例.选择正常皮肤组织10份作为对照.应用免疫组化方法分别检测IL-13、IL-13Rαl及IL-13Rα2的表达.结果 IL-13、IL-13Rα1和IL-13Rα2表达于各期MF皮损组织的异形淋巴样细胞和亲表皮性淋巴样细胞,IL-13Rα2几乎高表达于所有的MF皮损组织.正常皮肤组织及淋巴细胞均不表达IL-13及其受体.随着MF病程的进展,皮损组织IL-13及其受体表达率升高.IL-13、IL-13Rαl及IL-13Rα2的表达率在Ⅰ期MF皮损(分别为10.00％±3.14％、21.43％±6.88％、31.14％±6.38％)均显著低于Ⅱ期MF皮损(分别为27.50％±11.00％、39.45％ ± 9.43％、44.40％±11.15％),差异均有统计学意义(P＜0.05),但在ⅠA期与ⅠB期之间以及ⅡA期与ⅡB期之间差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 IL-13及其受体尤其是IL-13Rα2有望成为MF早期诊断和生物学行为预判的标志物.     

正常人黑素细胞MITF对酪氨酸酶相关蛋白的转录调控研究

目的 研究正常人黑素细胞小眼畸形相关转录因子(MITF)对与黑素生成密切相关的酪氨酸酶相关蛋白(TRPs)家族的转录调控.方法 应用小RNA干扰技术(慢病毒感染),对培养的原代正常人黑素细胞进行MITF基因沉默,然后应用实时定量PCR和免疫印迹方法,分别检测MITF基因沉默前后,MITF、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)的基因与蛋白表达水平.结果 正常人黑素细胞具有显著表达的MITF、TYR、TYRP1和TYRP2; MITF基因沉默后,MITF、TYR和TYRP1的基因表达水平分别下降2倍(P =0.001)、1.5倍(P=0.05)和5倍(P =0.005),TYRP2的表达水平上调3倍(P =0.004);而MITF基因沉默后的MITF、TYR、TYRP1的蛋白表达也显著下降,TYRP2蛋白显著升高.结论 黑素细胞TRPs家族与MITF转录调控密切相关,TYRP2可能存在不依赖于MITF的转录调控.     

肿瘤微环境对蕈样肉芽肿生物学行为的影响

蕈样肉芽肿是原发于皮肤的、具有独特临床表现、组织病理、免疫表型和遗传特征的皮肤T细胞淋巴瘤.蕈样肉芽肿肿瘤微环境由肿瘤细胞、局部浸润的免疫细胞、间质细胞及其所分泌的细胞因子等组成.树突细胞(包括朗格汉斯细胞)在蕈样肉芽肿发展的不同阶段发挥着双向作用,成熟树突细胞介导了抗肿瘤免疫反应,未成熟树突细胞诱导了免疫耐受反应.调节性T细胞与Th17细胞的功能失衡也决定了蕈样肉芽肿的进程,细胞因子特别是趋化因子在蕈样肉芽肿亲表皮现象中发挥重要作用,白介素10导致局部免疫抑制与蕈样肉芽肿预后密切相关.肿瘤微环境的改变决定了蕈样肉芽肿的病程发展规律与生物学行为.     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

窄谱中波紫外线联合干扰素治疗蕈样肉芽肿疗效及其与Treg/Th17细胞相关性研究

目的 观察窄谱中波紫外线（NB-UVB）单独或联合干扰素治疗覃样肉芽肿（MF）的疗效,探讨外周血调节性T（Treg）细胞和辅助性T细胞17（Th17）细胞与疗效的相关性。 方法 33例ⅠA期-ⅡA期MF患者按照治疗方法分为两组,分别应用NB-UVB单独照射（照射组）和NB-UVB照射联合重组人干扰素（INF）-α-2b肌内注射（联合组）治疗。于治疗前和治疗9个月后分别采集患者外周血,流式细胞仪检测Treg细胞和Th17细胞百分率。以10例健康人外周血为对照组（健康对照组）。 结果 平均治疗时间9个月,照射组15例中,完全缓解6例,部分缓解3例,无效6例,联合组18例中,完全缓解12例,部分缓解5例,无效1例,联合治疗效果显著优于单独治疗（P = 0.023）。治疗前两组患者外周血 Treg和Th17细胞百分率均明显高于健康人（均P < 0.05）,两患者组间差异无统计学意义（P > 0.05）;治疗后两患者组Treg和Th17细胞百分率均显著下降,但仍高于健康对照组（均P < 0.05）。联合组Treg和Th17细胞降幅均大于照射组（均P < 0.05）。7例治疗无效患者治疗后外周血Treg细胞较治疗前亦有降低（P < 0.05）,Th17细胞无显著下降（P > 0.05）。 结论 NB-UVB照射联合INF-α-2b肌内注射治疗MF临床疗效优于单独使用NB-UVB,疗效可能与外周血Treg和Th17细胞降幅有关。