埃及伊蚊多巴脱羧酶在蚊卵产出、孵化和抗干燥能力中的功能

目的 为了探究埃及伊蚊多巴脱羧酶（dopa decarboxylase, DDC）基因在蚊卵发育过程中所发挥的功能。 方法 首先通过荧光定量PCR技术构建DDC基因在埃及伊蚊中的时空表达谱,然后利用RNA干扰（RNAi）技术沉默埃及伊蚊成蚊DDC基因的表达,比较分析实验组与对照组的产卵量、卵孵化率和卵抗干燥能力。结果 DDC基因在卵时期表达量高于其他发育时期幼虫,在不同组织的相对表达量中,DDC基因在卵巢中转录本表达量水平约为胸部的5.35倍,是表皮和中肠的6.63倍和38.9倍。两个对照组间的产卵量和卵孵化率均无显著性差异（DEPC组产卵量和卵孵化率分别为122个/只蚊和95.1%;dsGUS组产卵量和卵孵化率分别为120个/只蚊和92.9%）。但实验组（dsDDC注射组）的产卵量（39个/只蚊）和孵化率（10%）均显著低于对照组（t=49.68,P<0.01）。在低湿度条件下（室温26 ℃,0~5%湿度）,0~10 min之内,对照组蚊卵壳结构和饱和度基本无变化,而dsDDC组蚊卵壳结构出现坍塌,卵饱和度明显下降;30 min之后,dsDDC组蚊卵已脱水干瘪,而对照组蚊卵仍保持较高的饱和度。结论 基于以上结果,本研究初步推断DDC基因从埃及伊蚊卵的形成到发育过程起到重要的调控作用。     

利用无缝克隆方法构建埃及伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A双向启动子苏云金芽孢杆菌穿梭载体

目的 构建表达dsRNA的双向启动子以及靶基因AaCPR100A的大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315-AaCPR100A。方法 以苏云金芽孢杆菌pSVP27A质粒为模板通过PCR扩增苏云金芽孢杆菌Cry3A正向启动子Pro-1（+）；以埃及伊蚊RNA反转为cDNA为模板，扩增靶基因AaCPR100A；将大肠-苏云金穿梭载体pHT315质粒经HindⅢ和SalⅠ双酶切线性化；按照转录方向将正向启动子与靶基因通过无缝克隆插入穿梭载体pHT315中；以生物合成的含有Cry3A反向启动子序列的质粒为模版，经PCR克隆扩增Pro-1（-）反向启动子；将含有正向启动子与靶基因的中间载体通过Eco RⅠ限制性酶切酶线性化，按转录方向在靶基因下游通过无缝克隆插入反向启动子。结果 经琼脂糖凝胶电泳检测，正向启动子、靶基因AaCPR100A和反向启动子PCR产物条带清晰，质量良好，可用于无缝克隆实验；经无缝克隆连接双向启动子以及靶基因片段后，对含有重组载体pHT315-AaCPR100A的重组质粒进行PCR验证，在重组载体中成功扩增正向启动子、靶基因片段以及反向启动子，经核苷酸测序验证双向启动子...