PAI－1糖基化位点突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡＩ－１）是一种Ｍｒ为５０×１０３的单链糖蛋白，有３７９个氨基酸残基，３个Ｎ型糖基化位点。构建ＰＡＩ－１糖基化突变体，以便研究糖链的功能。用寡核苷酸定位突变技术将３个糖基化位点２０９，２６５，３２９位进行突变，把３个糖基化位点都发生了突变的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ组装到真核表达载体ｐＳＶ２中，得到真核表达质粒ｐＺＨ－ｐ１－Ｍ３Ｅ；在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯｄｈｆｒ－）中进行短暂表达，用发色底物法和夹心ＥＬＩＳＡ方法检测培养液中ＰＡＩ－１的活性和含量。结果：糖基化位点突变的ＰＡＩ－１能在ＣＨＯ细胞中表达，但表达水平及活性较低。非糖基化ＰＡＩ－１的活性和抗原分别为４．３４ＩＵ／ｍｌ和３．１５μｇ／Ｌ结论：用寡核苷酸定位突变方法获得了ＰＡＩ－１糖基化突变体，并且在ＣＨＯ细胞中得到表达。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

制备水蛭素衍生物，首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序，设计了水蛭素的基因，基因中融合了ＲＧＤ三肽编码顺序，形成水蛭素衍生物编码基因，用ＤＮＡ合成仪，分１０个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中６个寡核苷酸组成Ｎ－端大片段，４个寡核苷酸组成Ｃ－端大片段。     

人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化

 目的 制备具有凝血活性的重组人组织因子（recombinant tissue factor, r-TF） 用于构建 PT 试剂盒。 方法 将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组，构建酵母表达质粒 pPIC9K-TF，利用电穿孔法转化宿主菌 Pichia pastoris GS115，转化子经 G418 抗性筛选后，获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导，表达 r-TF，表达产物经纯化后，鉴定生物活性。 结果 SDS-PAGE 证实表达产物的分子量为 37000-45000,Western-Blot证明其为人组织因子衍生物，纯化后，r-TF 经脂化后，具有促凝血活性，为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究 TF 的构效关系创造条件。 结论 用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF，表达量达到182mg/L。纯化工艺简便易行，蛋白回收率高，纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融会了ＲＧＤ３肽编码序列，通过连接、克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。结果：细胞培液中，重组水蛭素衍生物的活性达到１０ＡＴＵ／ｍｌ，并有抗血小板凝集作用。结论：水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景，但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

制备水蛭素衍生物，首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序，设计了水蛭素的基因，基因中融合了ＲＧＤ三肽编码顺序，形成水蛭素衍生物编码基因，用ＤＮＡ合成仪，分１０个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中６个寡核苷酸组成外端大片段，４个寡核苷酸组成Ｃ－端大片段。各大片段与载体ｐＵＣ１９重组和无性繁殖后，通过ＫｐｎⅠ位点连接成编码水蛭素衍生物分子的完整基因。经核苷酸顺序分析证实后，水蛭素衍生物基因与表达载体重组，转化大肠杆菌，筛选含重组质粒的细菌，命名为ｐＳＧＨＲＥ。结果：ｐＳＧＨＲＥ菌破碎后，上清和沉淀部分都有水蛭素活性。上清活性约２０ＡＴＵ／ｍｌ菌液。结论：我们构建了水蛭素衍生物基因的克隆并在大肠杆菌中得到表达。     

可溶性组织因子的基因克隆、表达与性质研究

组织因子是外源性凝血途径的启动因子，为膜受体蛋白，胞外区的促凝血功能几乎与完整分子相同，因此采用重组DNA技术制备组织因子的胞外区分子，并对其活性进行研究，以便替代兔脑粉用于PT检测。以人胎盘总RNA为模板，用RT－PCR扩增组织因子胞外区cDNA基因，经序列分析证实后大肠杆菌中表达，产物形成包涵体。表达产物经复性，离子交换和凝胶过滤色谱纯化后与磷脂结合，进行促凝血试验。结果表明在磷脂存在下，可溶性TF有明显的促凝血活性，可以取代兔脑粉有于PT检测。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融合了ＲＧＤ３编码序列，通过连接，克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。     

重组人HBNF的表达和提纯及其生物活性的测定

目的 通过酵母表达系统表达重组人亲肝素性促轴突生长因子(heparin—binding neuritepromoting factor，HBNF)蛋白并检测其生物活性。方法 将重组表达质粒pPIC9k／HBNf通过电穿孔法转入酵母表达系统GSI15，利用G418筛选高拷贝子用于大量表达HBNF、蛋白，再检测其生物活性。结果 通过G418筛选出抗性大于2mg／mL的高拷贝子，大量表达、提纯后获得相对分子质量约18000蛋白，Western—blot证实为HBNF蛋白，生物活性检测显示提纯HBNF有显著的神经营养作用。结论 通过酵母表达系统获得的重组人HBNF有一定的生物活性。     

尸体标本中皮肤色变的研究

浸泡于甲醛中的尸体皮肤日久后颜色变深,以往倾向于认为此系血红蛋白中辅基铁卟啉的氧化所致。本实验利用血红蛋白的特征性吸收光谱、还原后的光谱改变及血红素-氯化物结晶的方法证明在皮肤表皮中不存在血红蛋白或血红素。将尸体表皮经酸水解后可分成三个色素部分,即脂溶性色素、水溶性色素及酸不溶的黑色沉淀,此黑色沉淀经红外光谱及碱熔融后层析鉴定证明与头发中的黑色素相同,故而推测尸体皮肤的色变很可能与黑色素有关,并探讨了黑色素形成的机制。     

生物化学和分子生物学

0500591 包含BTB锌指结构的新基因Bsg2结构特性及其在发育阶段的组织表达特异性，0500592 HeLa细胞中Skp2的表达调控p21^WAF/CIP1稳定性,0500593 登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用,0500594 转录因子XBP-1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备,0500595 N端缺失突变对核糖核酸酶抑制因子活性的影响.