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Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)是一种Mr为50×103的单链糖蛋白,有379个氨基酸残基,3个N型糖基化位点。构建PAI-1糖基化突变体,以便研究糖链的功能。用寡核苷酸定位突变技术将3个糖基化位点209,265,329位进行突变,把3个糖基化位点都发生了突变的PAI-1cDNA组装到真核表达载体pSV2中,得到真核表达质粒pZH-p1-M3E;在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHOdhfr-)中进行短暂表达,用发色底物法和夹心ELISA方法检测培养液中PAI-1的活性和含量。结果:糖基化位点突变的PAI-1能在CHO细胞中表达,但表达水平及活性较低。非糖基化PAI-1的活性和抗原分别为4.34IU/ml和3.15μg/L结论:用寡核苷酸定位突变方法获得了PAI-1糖基化突变体,并且在CHO细胞中得到表达。 相似文献
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水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:7,自引:0,他引:7
制备水蛭素衍生物,首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序,设计了水蛭素的基因,基因中融合了RGD三肽编码顺序,形成水蛭素衍生物编码基因,用DNA合成仪,分10个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中6个寡核苷酸组成N-端大片段,4个寡核苷酸组成C-端大片段。 相似文献
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目的 制备具有凝血活性的重组人组织因子(recombinant tissue factor, r-TF) 用于构建 PT 试剂盒。 方法 将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组,构建酵母表达质粒 pPIC9K-TF,利用电穿孔法转化宿主菌 Pichia pastoris GS115,转化子经 G418 抗性筛选后,获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导,表达 r-TF,表达产物经纯化后,鉴定生物活性。 结果 SDS-PAGE 证实表达产物的分子量为 37000-45000,Western-Blot证明其为人组织因子衍生物,纯化后,r-TF 经脂化后,具有促凝血活性,为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究 TF 的构效关系创造条件。 结论 用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF,表达量达到182mg/L。纯化工艺简便易行,蛋白回收率高,纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。 相似文献
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设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因,并融会了RGD3肽编码序列,通过连接、克隆、酶切筛选、DNA序列分析,得到真核表达质粒pAPR-HD,表达质粒转染CHL细胞,经G418筛选,获得表达克隆。结果:细胞培液中,重组水蛭素衍生物的活性达到10ATU/ml,并有抗血小板凝集作用。结论:水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景,但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。 相似文献
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制备水蛭素衍生物,首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序,设计了水蛭素的基因,基因中融合了RGD三肽编码顺序,形成水蛭素衍生物编码基因,用DNA合成仪,分10个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中6个寡核苷酸组成外端大片段,4个寡核苷酸组成C-端大片段。各大片段与载体pUC19重组和无性繁殖后,通过KpnⅠ位点连接成编码水蛭素衍生物分子的完整基因。经核苷酸顺序分析证实后,水蛭素衍生物基因与表达载体重组,转化大肠杆菌,筛选含重组质粒的细菌,命名为pSGHRE。结果:pSGHRE菌破碎后,上清和沉淀部分都有水蛭素活性。上清活性约20ATU/ml菌液。结论:我们构建了水蛭素衍生物基因的克隆并在大肠杆菌中得到表达。 相似文献
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可溶性组织因子的基因克隆、表达与性质研究 总被引:4,自引:0,他引:4
组织因子是外源性凝血途径的启动因子,为膜受体蛋白,胞外区的促凝血功能几乎与完整分子相同,因此采用重组DNA技术制备组织因子的胞外区分子,并对其活性进行研究,以便替代兔脑粉用于PT检测。以人胎盘总RNA为模板,用RT-PCR扩增组织因子胞外区cDNA基因,经序列分析证实后大肠杆菌中表达,产物形成包涵体。表达产物经复性,离子交换和凝胶过滤色谱纯化后与磷脂结合,进行促凝血试验。结果表明在磷脂存在下,可溶性TF有明显的促凝血活性,可以取代兔脑粉有于PT检测。 相似文献
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水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因,并融合了RGD3编码序列,通过连接,克隆、酶切筛选、DNA序列分析,得到真核表达质粒pAPR-HD,表达质粒转染CHL细胞,经G418筛选,获得表达克隆。 相似文献
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目的 通过酵母表达系统表达重组人亲肝素性促轴突生长因子(heparin—binding neuritepromoting factor,HBNF)蛋白并检测其生物活性。方法 将重组表达质粒pPIC9k/HBNf通过电穿孔法转入酵母表达系统GSI15,利用G418筛选高拷贝子用于大量表达HBNF、蛋白,再检测其生物活性。结果 通过G418筛选出抗性大于2mg/mL的高拷贝子,大量表达、提纯后获得相对分子质量约18000蛋白,Western—blot证实为HBNF蛋白,生物活性检测显示提纯HBNF有显著的神经营养作用。结论 通过酵母表达系统获得的重组人HBNF有一定的生物活性。 相似文献
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0500591 包含BTB锌指结构的新基因Bsg2结构特性及其在发育阶段的组织表达特异性,0500592 HeLa细胞中Skp2的表达调控p21^WAF/CIP1稳定性,0500593 登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用,0500594 转录因子XBP-1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备,0500595 N端缺失突变对核糖核酸酶抑制因子活性的影响. 相似文献