RNA干扰Cdx2基因沉默对人胃癌裸鼠耐药模型Survivin和C-myc表达的影响

目的观察携带人尾型同源盒转录因子2（Cdx2）基因沉默的重组慢病毒颗粒（Cdx2-RNAi-LV）对人胃癌耐顺铂细胞SGC-7901／DDP裸鼠皮下移植瘤中Survivin和C—myc表达的影响。方法建立人胃癌耐顺铂细胞SGC-7901／DDP裸鼠皮下移植瘤模型,36只裸鼠随机分成3组（n=12）：PBS组、LV-RNAi组、Cdx2．RNAi-LV组;各组瘤体内分别注射磷酸盐缓冲液、慢病毒颗粒（0．5×10^8TU／m1）、含Cdx2基因重组慢病毒颗粒（0．5×10^8TU／m1）相应药物100μl,1次／3d,共6次;同时所有裸鼠腹腔注射药物顺铂（25mg／kg）,隔天1次,共10次;注射Cdx2-RNAi-LV病毒颗粒第20天后脱颈椎法处死裸鼠,完整切取肿瘤组织,并应用PT-PCR和Westernblot技术检测移植瘤中Survivin和C．myc基因的表达。结果Cdx2．RNAi．LV组、LV．RNAi组和PBS组的细胞均有Survivin、C—myc的mRNA和蛋白的表达,但各组细胞对应的Survivin、C—myc的mRNA和蛋白的表达水平有差别;Cdx2-RNAi—LV组Survivin、C．myc的mRNA和蛋白的表达量较PBS组和LV．RNAi组明显下调（P〈0．05）,而PBS组和LV—RNAi组比较差异元统计学意义（P〉0．05）。结论Cdx2基因沉默重组慢病毒颗粒瘤内注射下调人胃癌耐顺铂细胞裸鼠移植瘤Survivin和C-myc表达,可能是Cdx2基因沉默逆转肿瘤的耐药性机制之一。     

Effects of 5-FU combined compound Ginseng and Astragalus on biological behavior of human gastric cancer MGC-803 cells

Objective To observe the in vitro effects of 5-fluorouracil(5-FU) combined Compound Ginseng and Astragalus(CGA) on the biological behaviors such as the proliferation,the cloning,apoptosis and migration of human gastric cancer MGC-803 cells. Methods The cell proliferation inhibition rate was detected by MTT assay,     

eIF4A1基因沉默对胃癌SGC-7901细胞生物学行为影响机制的探讨

目的探讨沉默eIF4A1基因对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移的细胞生物学行为影响的机制。方法以eIF4A1沉默重组慢病毒颗粒(LV-EIF4A1-RNAi组)感染人胃癌SGC-7901为eIF4A1沉默组(eIF4A1-RNAi组),感染阴性对照慢病毒颗粒(CON077)的胃癌细胞为阴性对照组(CON077组),空白对照组(control组)不作任何处理。以每个副孔初始含4×10~3个细胞,CCK-8检测各组细胞增殖能力;流式细胞仪检测各组5×10~6个细胞凋亡和1×10~6个细胞周期分布;Transwell实验检测各组1×10~5个细胞迁移和侵袭能力;实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞eIF4A1和AKT基因的mRNA和蛋白表达水平。结果 LV-EIF4A1-RNAi(44683-1)组eIF4A1基因的表达量最低为(0.31±0.04),因此选择该组为eIF4A1沉默组(eIF4A1-RNAi)。与CON077组和control组相比,eIF4A1-RNAi组细胞增殖活力明显降低,细胞凋亡率提高,细胞周期阻滞于S期,G1/G2期细胞减少,细胞的迁移、侵袭能力下降,eIF4A1和AKT基因的mRNA和蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P0.05);CON077组与control组比较,上述指标差异均无统计学意义(P0.05)。结论慢病毒介导eIF4A1基因沉默能抑制人胃癌细胞株SGC-7901的增殖和迁移、促进细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期,其机制可能与AKT表达下调有关。     

siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响

目的 应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响.方法 将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1 mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法（Western blot）检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况.采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异.结果 重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%（P〈0.05）和66.60%（P〈0.05）,差异有统计学意义.结论 沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生.     

siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响

目的应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响。方法将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法(Western blot)检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况。采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异。结果重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%(P0.05)和66.60%(P0.05),差异有统计学意义。结论沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生。     

尾型同源盒基因2过表达对人胃癌耐顺铂细胞SGC7901／DDP多药耐药性的影响

目的探讨尾型同源盒基因2（Cdx2）过表达对人胃癌耐顺铂细胞SGC7901／DDP的多药耐药性的影响。方法将SGC7901／DDP细胞分为实验组[Cdx2过表达重组慢病毒载体（pCMA-Cdx2-HA）处理]、空载体组[慢病毒载体（pCMA-HA）处理]、对照组（不做处理）3组。MTT法检测各组SGC7901／DDP细胞对化疗药物的敏感性;流式细胞仪检测各组SGC7901／DDP细胞阿霉素的泵出蓄积量、细胞周期分布及凋亡情况;Westernblot技术进一步检测Cdx2蛋白和多药耐药基因1（MDRl）的蛋白表达水平。组间比较采用方差分析。结果SGC7901／DDP细胞感染慢病毒载体72h后,转染效率达90％以上。实验组Cdx2蛋白的相对表达量为0．374-0．06,较空载体组的0．12±0．02和对照组的0．11±0．03明显升高,3组比较,差异有统计学意义（F=82．37,P〈0．05）。实验组SGC7901／DDP细胞对阿霉素、5．氟尿嘧啶和顺铂的半数凋亡浓度分别为（1．10±0．08）mg／L、（4．81±0．12）mg／L、（3．81±0．15）mg／L,均高于空载体组的（0．59±0．05）mg／L、（3．71±0．14）mg／L、（2．20±0．15）mg／L和对照组的（0．63±0．04）mg／L、（3．92±0．15）mg／L、（2．92-4-0．11）mg／L,3组比较,差异有统计学意义（F=158．75,98．06,188．78,P〈0．05）。实验组阿霉素的泵出率为18．20％±0．12％,高于空载体组的7．22％±0．09％和对照组的8．79％4-0．11％,3组比较,差异有统计学意义（F=146．31,P〈0．05）。实验组G．期细胞的比例为52．2％±4．4％,明显低于空载体组的62．0％±5．O％和对照组的67．8％±3．3％;实验组S期的细胞比例为40．4％±1．5％,明显高于空载体组的25．6％±2．O％和对照组的21．8％±1．3％,3组细胞G．期和S期比较,差异均有统计学意义（F=17．08,236．83,P〈0．05）。实验组细胞凋亡率为7．6％±1．3％,明显低于空载体组的11．1％±1．1％和对照组的10．8％±1．0％,3组比较,差异有统计学意义（F=16．29,P〈0．05）。实验组中MDRl蛋白的表达量为1．854-0．18,高于空载体组的1．124-0．08和对照组的1．024-0．09,3组比较,差异有统计学意义（F=76．22,P〈0．05）。结论Cdx2基因的过表达可降低胃癌耐顺铂细胞SGC7901／DDP对化疗药物的敏感性,降低化疗药物在胃癌细胞内的蓄积浓度,增强胃癌多药耐药细胞的耐药性。     

转录因子CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖和细胞周期的影响*

 目的： 探索CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖、生长和细胞周期的影响及其分子机制。方法: 采用携带CDX2基因的重组慢病毒颗粒（LV-CDX2-GFP）感染SGC-7901细胞,作为实验组（LV-CDX2-GFP组）;以对照慢病毒颗粒（LV-GFP）感染SGC-7901细胞,作为阴性对照组（LV-GFP组）;空白对照组常规培养,不做任何处理。分别采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组细胞周期的分布,半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting技术检测细胞中CDX2、Bax、Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达。结果: 与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-CDX2-GFP组细胞增殖活力明显降低(P<0.05),G0/G1期所占比例上升(P<0.05),Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达降低（P<0.05）,Bax mRNA和蛋白的表达上调（P<0.05）,而LV-GFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论: 慢病毒介导的CDX2过表达抑制胃癌细胞增殖和生长,使细胞周期停滞在 G0/G1期,其机制可能与CDX2过表达使胃癌细胞Bcl-2、cyclin D1、survivin表达下调和Bax表达上调有关。