ATM基因siRNA真核表达载体的构建及其对转染宫颈癌细胞株ATM表达的抑制作用

目的:研究特异性siRNA对宫颈癌ATM基因的阻抑效果以及用RNAi效应对宫颈癌做基因治疗的可行性. 方法:构建可表达人ATM基因siRNA的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-ATM,电穿孔法转染Siha宫颈癌细胞株. 应用RT-PCR,Western blot,流式细胞术、免疫荧光法等方法检测转染的宫颈癌细胞中ATM基因的表达水平. 结果:RT-PCR, Western-blot均表明瞬时转染pSuppressorNeo-ATM的宫颈癌细胞中ATM 基因的表达受到明显抑制,流式细胞术、免疫荧光法检测表明ATM蛋白含量明显下降. 结论:pSuppressorNeo-ATM质粒构建成功,瞬时转染宫颈癌细胞后可以明显抑制ATM基因的表达.     

抑制ATM表达对60Co照射下宫颈癌细胞损伤修复机制的影响

目的：探讨抑制毛细血管扩张-共济失调突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）表达对人宫颈癌细胞株HeLa在^60Co照射下细胞损伤修复机制的影响。方法：电穿孔法将人ATM基因siRNA的重组真核表达质粒pSup．ATM转染宫颈癌HeLa细胞；G418筛选建立稳定转染株；RT-PCR、Western-blot、免疫荧光法检测ATM基因表达的抑制情况；Western-blot法检测^60Co照射前后各组细胞ATM、p53Ser15磷酸化、CHK2Thr 68磷酸化、p53、CHK2蛋白的表达水平；流式细胞术检测^60Co照射后各组的细胞周期变化。结果：ATM基因在HeLa^ATM细胞中表达明显低于在HeLa、HeLa^ms细胞中的表达水平，成功地建立了ATM低表达的宫颈癌细胞模型。HeLa^ATM细胞在^60Co照射后p53^Ser15磷酸化、CHK2^Thr68磷酸化、p53蛋白表达均显著降低，细胞周期呈现为G2期延长，G1／G2倒置。结论：抑制ATM基因表达可显著抑制宫颈癌细胞对^60Co辐射损伤的修复。这一机制可能与HeLa^ATM细胞中ATM蛋白表达缺失，ATM依赖性的细胞损伤修复通路受阻有关。