p21WAF1与p27KIP1真核双表达载体的构建鉴定及在胃癌细胞中的表达

目的 构建p21WAF1与p27KIP1真核双表达载体,体外转染胃癌7901细胞,观察其在胃癌细胞中的表达及相关特性.方法 提取人全血总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增p21WAF1和p27WAF1基因并将其分别克隆到真核双表达载体pIRES中构建重组质粒pIPES-p27KIP1-p21WAF1,经酶切和测序鉴定重组质粒.脂质体介导重组质粒plRES-p27KIP1.p21WAF1"转染胃癌7901细胞,收集并提取转染后12、24、48、72 h和5 d各细胞的总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各细胞中p21WAF1和p27KIP1在RNA水平的表达.带有绿色荧光蛋白的pIRES-EGFP作为对照.结果 RT-PCR扩增分别获得约500和600 bp大小的产物,重组质粒pIRES-p27KIP1.p21WAF1经酶切和测序鉴定证实为p21WAF1和p27KIP1基因.转染胃癌7901细胞48 h时转染率为68%.与空质粒对照组比较,重组质粒转染胃癌7901细胞12、24、48、72 h和5 d后FQ-PCR证实p27KIP1的Ct值(cycle threshold,Ct)分别减少8.2、10、10、7.4和6.7,p21WAF1的Ct值分别减少7.4、8.2、8.2、6.3和5.70其中24 h和48 h的Ct值减少最大.结论 真核双表达载体pIRES-p27KIP1.p21WAF1构建成功并能在胃癌7901细胞内高效表达.     

缺氧诱导胶质瘤干细胞向血管内皮细胞分化潜能的实验研究

胶质瘤占脑内肿瘤的40％ ～ 45％,具有高侵袭性、高度增殖性,传统手术加放化疗等综合治疗手段主要针对的是肿瘤细胞,疗效不佳[1-3].根据肿瘤的生长、侵袭有赖于肿瘤血管生成的理论产生了抗肿瘤血管生成治疗肿瘤策略,但目前常规的抗肿瘤血管生成治疗效果仍不尽人意[4 ],说明可能存在其他的肿瘤血管生成的机制或其他影响肿瘤血管生成的因素.缺氧可上调人血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGFR)的表达,而VEGF是刺激肿瘤血管生成最关键的生长因子,本研究在缺氧条件下培养脑胶质瘤干细胞,探讨其与肿瘤血管生成的关系,为改进抗肿瘤血管生成策略提供新的思路.     

骨髓基质干细胞片层复合聚乳酸羟基乙酸支架构建组织工程骨

目的 制备骨髓基质干细胞片层,探讨其对组织工程骨成骨的作用.方法 培养骨髓基质干细胞(BMSCs)并向成骨方向诱导,利用温度反应性培养皿制备骨髓基质干细胞片层,光学及电子显微镜下观察其形态.将经过预处理的三维多孔聚乳酸羟基乙酸(PLGA)支架注射BMSCs悬液并复合干细胞片层后植入犬左侧下颌骨缺损,为实验侧;将未复合细胞片层的支架植入右侧,为对照侧.16周后,对新生骨行影像学及组织学观察分析.结果 片层中细胞排列紧密,生长活跃.实验侧吸光度值高于对照侧(P＜0.05),并可见较多哈弗系统及板层骨样结构.结论 经温度反应性培养皿制备的干细胞片层结合PLGA支架可形成具有板层状结构的组织工程骨.     

基于环介导等温扩增技术的巴戟天检测方法的建立

目的 建立一种可快速检测中药巴戟天的环介导等温扩增(LAMP)检测方法.方法 针对巴戟天二级内部转录空间(ITS2)序列设计LAMP特异引物组,提取DNA后建立基于LAMP技术鉴别巴戟天的目视和实时定量检测方法,同时评估该方法的特异性、灵敏度及其在实践中的应用情况.结果 该检测方法具有良好的特异性,最适反应温度为63℃...     

非小细胞肺癌组织中 EGFR、HER-2蛋白的表达变化及意义

目的：观察非小细胞肺癌（NSCLC）组织中表皮生长因子受体（EGFR）、人类表皮生长因子受体2（HER-2）蛋白表达变化,并探讨其意义。方法采用免疫组化方法检测68例NSCLC组织和20例癌旁组织中EGFR、HER-2蛋白的表达,并分析两者间及与肿瘤临床病理参数的关系。结果 EGFR与HER-2蛋白在NSCLC组织中的表达阳性率分别为54．4％、66．1％,在癌旁组织中均未见表达,两两比较P均＜0．05;EGFR蛋白表达与NSCLC病理类型及有无淋巴结转移有关,HER-2蛋白表达与肿瘤TNM分期及有无淋巴结转移有关（ P均＜0．05）;EGFR与HER-2蛋白表达呈正相关（P＜0．05）。结论 EGFR、HER-2蛋白在NSCLC组织中呈高表达,两者可能协同参与肿瘤发生、发展、侵袭及转移。     

人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的：自行构建人血小板源性生长因子B（PDGF-B）真核表达载体，为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法：实验于2002-01／2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据GeIlbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列，设计合成一对附加BamHⅠ，XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段，将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。⑧经测序鉴定后，再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果：反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论：成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因，构建了基因重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究，在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞*

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA 和蛋白进行检测。结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d 的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR 和 Western blot 结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA 和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

直肠癌术后并外阴巨大转移瘤患者的护理

临床资料患者,女,52岁,因直肠癌术后4年,外阴转移5个月,于2004年8月24日入院。查体:患者腹壁有一肠造瘘口,自阴道口后壁膨出1个8cm×6cm×5cm肿块,菜花状,质硬,活动度差,疼痛,恶臭,遮盖尿道口,带1留置尿管,阴道内大量积脓、入院后给予姑息放射治疗。9月1日,患者外阴肿瘤破裂大出血,出血量300ml,经及时处理,出血停止。患者放疗5周,肿瘤缩小至4cm×3cm×2cm,留置尿管,好转出院。讨论留置尿管的护理:患者自外院留置尿管1个月,入院后给予更换尿管时遇到困难,因尿道口被巨大肿瘤遮挡,距肿瘤上缘1.5cm,常规导尿无法置入尿管,我们采用导丝引导下置…     

噬血细胞综合征22例

目的探讨儿童噬血细胞综合征（HPS）的临床表现、病因、治疗及预后。方法回顾性分析2004年1月-2006年12月青岛大学医学院附属医院儿科收治的22例HPS患儿临床资料,总结其特点。结果1.临床表现：主要为持续发热,肝、脾、淋巴结大,出血。2.实验室检查特点：外周血常规表现为三系或二系减少,肝功能受损,凝血障碍,高三酰甘油和（或）纤维蛋白原降低。骨髓涂片可找到噬血细胞。免疫紊乱：CD3、CD4降低,CD8升高。3.病因：原发性和获得性,获得性包括感染和恶性肿瘤相关,其中以EB病毒最为常见,EB病毒感染占感染相关性HPS（IAHS）的63.64%（7/11例）,占HPS的31.82%（7/22例）。EBV相关HPS表现重,尤其EBV DNA定量阳性者临床凶险,病死率高。1例恶性相关性HPS（MAHS）有EBV DNA低量表达,且EBV-CA-IgM阳性,为EB病毒感染,余3例病因不明。4.治疗及转归：IAHS 11例予抗病毒药物、大剂量人血丙种球蛋白、糖皮质激素、依托泊苷治疗,好转5例,疗效不佳自动出院1例,放弃治疗2例,死亡3例。MAHS 4例,予糖皮质激素、依托泊苷等治疗,对早期治疗反应良好,易复发,复发后恶性病程,预后差。1例0.5 a余转化为淋巴瘤;1例10个月余转为急性淋巴细胞性白血病;1例3个月余转为郎格汉斯组织细胞增生症,进行性急速加重;前3例均迅速死亡。1例EBV感染MAHS,最终转化为郎格汉斯组织细胞增生症,肝功能不良,持续3 a。家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症1例,经HLH-04方案治疗好转,近1 a复发,死于多脏器衰竭,中枢浸润。6例病原不清HPS,亦予上述治疗,死亡、好转各3例。结论HPS多由感染尤其为EBV感染诱发,且与细胞免疫有极大关系,早期诊断、早期治疗是改善预后的关键。     

蛋白免疫印迹法检测胃癌中Cyr 61和HIF-1α蛋白的表达及其临床意义

目的本研究旨在检测Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达水平,探讨二者与胃癌侵袭转移的关系。方法将标本分成3组,分别为49例胃癌组,49例配对的癌旁组(距癌2cm)和49例配对的正常组(距癌5cm以上),用蛋白免疫印记(Western blot)方法检测Cyr61和HIF-1α的蛋白表达水平,并分析二者与胃癌的临床病理特征的关系。结果胃癌中Cyr61蛋白的表达水平(0.2767±0.02200)显著高于癌旁组织(0.2145±0.02209)和正常组织(0.1055±0.02082),癌旁组织明显高于正常组织(P均0.001);胃癌中HIF-1α蛋白的表达水平(0.2663±0.02682)显著高于癌旁组织(0.2120±0.04087)和正常组织(0.1008±0.03867)(P均0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P0.001)。Cyr61和HIF-1α蛋白表达的增强与肿瘤的分化程度、淋巴转移及TNM分期显著相关(P均0.05)。Sperman等级相关分析证明了Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白的表达呈明显正相关(r=0.411,P0.05)。结论 Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中呈高表达,且Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白表达的增强可促进胃癌的侵袭转移。联合检测Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白对指导胃癌临床诊治及判断预后有重要价值。