微小核糖核酸-34a对肝星状细胞增殖及活化的影响

目的 观察慢病毒表达载体介导微小核糖核酸-34a(miRNA-34a)体外转染肝星状细胞-T6(HSC-T6)后对肝星状细胞增殖率及活化的影响,探讨miRNA-34a在肝纤维化中可能的作用.方法 体外培养HSC-T6细胞,分别对miRNA-34a重组慢病毒组和空白对照病毒组转染肝星状细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖抑制率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)、Western印迹法检测HSC-T6细胞转化生长因子-β1 (TGF-β1)、a-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和基质金属蛋白酶3 (MMP3) mRNA及蛋白表达.组间差异采用单因素方差分析,方差齐性者两两比较采用LSD法,方差不齐者采用Dunnett T3检验,相关性检验采用Pearson直线相关分析.结果 转染效率为80％;与空白对照病毒组相比,转染后RT-PCR显示,miRNA-34a重组慢病毒组miRNA-34a mRNA的含量是3.6,其表达量明显升高;miRNA-34a重组慢病毒组肝星状细胞增殖率明显降低(24、48及72 h的F值分别为9.048、168.070、812.390,均P＜0.05);TGF-β1和α-SMA mRNA的表达量均降低,相对于空白对照病毒组的含量分别为0.28和0.13;TGF-β1和α-SMA蛋白表达量均降低(F=64.444、90.577,均P＜0.05);而MMP3表达量明显升高(F=374.584,P＜0.05).结论miRNA-34a能抑制肝星状细胞增殖和活化,有望在治疗肝纤维化中发挥作用.     

半乳糖凝集素-3在大鼠肝纤维化组织中的表达及意义

目的研究半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)、a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,a-SMA)在肝纤维化大鼠模型中的动态表达及意义。方法雄性SD大鼠随机分为健康对照组6只,肝纤维化模型组24只,采用二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射制备肝纤维化模型。分别在造模后2、4、6、8周门静脉采血检测血清ALT、AST、Alb,采用HE及Masson染色观察肝组织学变化,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时间点肝脏galectin-3 mRNA的表达。结果正常肝组织中有galectin-3低表达,2周即升高,4周达高峰,6周下降,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,galectin-3水平与TGF-β1、a-SMA呈正相关(r=0.882～0.963,P<0.01)。结论 Galectin-3可能与肝纤维化的发生发展过程密切相关。     

丁酸钠对自身免疫性肝炎辅助性T淋巴细胞17及肝脏Toll样受体4信号通路的影响CSCD

目的了解丁酸钠对小鼠自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）Th17的调节作用及对肝脏Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）4炎症通路的影响。 方法将50只6周龄雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为对照组、AIH组、丁酸钠组和高纤维组,每组10只,余10只小鼠用于提取肝脏特异性抗原S-100。诱导AIH模型建立后,丁酸钠组予500 mg/（kg·d）丁酸钠灌胃治疗,高纤维组予订制高纤维饲料喂养,持续3周后处死。观察各组小鼠肝脏病理变化,血清ALT、AST、IL-17A和TNF-α水平,脾脏Th17比例、肝脏TLR4、髓样分化因子（myeloid differentiation factor, MyD）88表达情况。对各样本均数进行正态性检验和方差齐性分析,各样本均数比较采用单因素方差分析。结果丁酸钠组及高纤维组小鼠肝脏炎症细胞浸润及细胞坏死明显比AIH组减轻。对照组、AIH组、丁酸钠组及高纤维组ALT分别为（24.833±2.229）、（88.333±9.543）、（27.167±3.189）和（29.833±6.113） U/L,AST分别为（97.000±14.953）、（285.000±35.434）、（139.500±38.976）和（127.167±28.687） U/L,各组间差异均有统计学意义（F值分别为156.491、44.118,均P〈0.01）。丁酸钠组和高纤维组小鼠脾脏Th17比例及其转录因子维甲酸相关孤儿受体γt明显低于AIH组,差异均有统计学意义（F值分别为21.780和68.283,均P〈0.05）;AIH组小鼠肝脏TLR4和MyD88蛋白表达明显高于对照组,丁酸钠组及高纤维组表达则被抑制,差异均有统计学意义（F值分别为26.235、28.293,均P〈0.01）;与AIH组相比,丁酸钠组及高纤维组肝脏和外周血中IL-17和TNF-α表达均降低。结论丁酸钠对自身免疫性肝炎进行免疫调节,改善肝脏炎性反应。     

kielin/chordin样蛋白在肝纤维化模型中的动态表达及骨形成蛋白-7干预后的表达变化

目的 观察kielin/chordin样蛋白(kcp)在肝纤维化小鼠模型中的动态表达及骨形成蛋白-7(BMP-7)干预对其表达的影响,探讨治疗肝纤维化的新靶点.方法 健康雄性ICR小鼠50只,分为正常对照组(10只)、模型组(30只)和BMP-7干预组(10只),模型组再按造模不同时间点分4、8、12周3个亚组,每组10只.模型组小鼠皮下注射四氯化碳制备肝纤维化小鼠模型,BMP-7干预组在造模后第8周开始腹腔注射人重组BMP-7,持续4周.造模后各组小鼠下腔静脉采血测定血清ALT、AST和Alb;肝组织经HE和Masson染色后光学显微镜下观察各组病理变化;采用RT-PCR、免疫组织化学和Western印迹法分别检测各组kcp mRNA及蛋白表达情况.各组间均数比较采用单因素方差分析.结果 模型组血清ALT、AST升高,A1b降低,12周时达峰值,BMP-7干预组有所缓解,各组间比较,差异有统计学意义(F值=23.501、34.600、16.244,均P＜0.05).正常对照组kcp mRNA和蛋白表达很低,模型组则逐渐升高,BMP-7干预组有所缓解,差异有统计学意义(F值=30.362、10.727,P＜0.01或0.05).kcp mRNA表达水平与转化生长因子β1( TGF-β1)、BMP-7 mRNA表达水平均呈正相关(r=0.760、0.769,均P＜0.05).结论 BMP-7能改善小鼠肝纤维化;kcp可能参与肝纤维化发生发展过程,有望成为肝纤维化治疗的新靶点.     

高脂饮食对自身免疫性肝炎肝损伤与焦亡的研究CSCD

目的探讨高脂饮食（high-fat diet, HFD）对小鼠自身免疫性肝炎（autoimmune hepatits, AIH）肝脏损伤的影响。方法50只C57BL/6雄性小鼠选取6只为S-100制备组,剩余小鼠用随机数字法随机分成标准饮食组（standard chow, SC）、HFD组、AIH＋SC组及AIH＋HFD组,喂饲1周后进行AIH造模,4周后处死小鼠,收集小鼠肝脏、脾脏、血清,进行HE染色观察肝组织病理学改变;检测小鼠血清中ALT和AST变化;蛋白质印迹法和实时PCR法检检测肝组织中Nod样受体蛋白3（NLR pyrin domain containing 3, NLRP3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-1）的表达;ELISA试剂盒检测血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量;流式细胞仪分析脾脏中Th17细胞的数量。各组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,每两组间比较方差齐性采用SNK-q检验,方差不齐采用非参数检验。结果HFD组肝组织可见少许脂肪空泡形成,AIH＋SC组可见血管周围炎性反应,AIH＋HFD组可见炎性反应加重,出现少许空泡样脂肪变性。与SC组小鼠相比,AIH＋SC组和HFD组小鼠的血清ALT和AST水平有所增加,AIH＋HFD组上升最为明显,各组均数相比差异均具有统计学意义（F值分别为57.12和37.58,P均〈0.05）。SC组外周血中Th17占CD4＋T细胞的比例为（2.98±0.90）%,HFD组为（6.89±0.99）%,AIH＋SC组为（6.47±1.08）%,AIH＋HFD组为（9.96±0.83）%,各组之间比较及两两比较差异有统计学意义（F＝54.05,P〈0.05）。SC组各血清细胞因子浓度分别为IL-1β [（7.62±2.81） ng/L]、IL-6 [（106.54±53.08） ng/L]、TNF-α [（107.26±36.20） ng/L];HFD组分别为IL-1β [（25.06±7.09） ng/L]、IL-6 [（220.11±47.41） ng/L]、TNF-α [（273.77±33.62） ng/L];AIH＋SC组分别为IL-1β [（17.49±5.68） ng/L]、IL-6[（260.73±50.29） ng/L]、TNF-α [（250.49±81.63） ng/L];AIH＋HFD分别为IL-1β [（52.04±10.22） ng/L]、IL-6 [ （785.93±70.91） ng/L]、TNF-α [（913.97±64.57） ng/L],各组之间差异均有统计学意义（F值分别为44.66、242.15、233.49,均P〈0.05）。HFD组和SC组相比、AIH＋HFD组与AIH＋SC组相比,NLRP3、Caspase-1表达明显上升,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论HFD促进AIH,可能是通过促炎因子分泌、促进Th17细胞活化和促进炎症小体NLRP3激活进而促进细胞焦亡。     

骨成形蛋白7对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用

目的 研究骨成形蛋白7 (BMP7)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用.方法 体外培养HSC-T6细胞,分为对照组、TGFβ1组、TGFβ1+ BMP7组和TGFβ1+ BMP7+ Noggin组.RT-PCR法检测果蝇蛋白质1(smad1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、gremlin和纤维连接蛋白(FN)mRNA的表达,Western印迹法检测磷酸化smad1/5/8(P-smad1/5/8)、α-SMA、gremlin蛋白的表达.采用单因素方差分析、LSD检验、Dunnett T3检验和Pearson直线相关分析进行统计学处理.结果 对照组HSC-T6细胞中可见P-smad1/5/8、α-SMA、gremlin及FN的表达,TGFβ1刺激后表达量明显增加,差异有统计学意义(均P＜0.05).与TGFβ1组比较,TGFβ1+ BMP7组α-SMA、gremlin及FN表达下调,但P-smad1/5/8蛋白表达增加(1.613±0.031比2.503±0.014;t=34.89,P＜0.05).TGFβ1+ BMP7+ Noggin组α-SMA、gremlin及FN表达较TGFβ1+ BMP7组增加,而P-smad1/5/8蛋白表达下调(t=34.05,P＜0.05).smadl mRNA在各组表达均无显著变化.结论 BMP7对α-SMA、gremlin和FN均有较强的抑制作用.