人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响

目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。     

生物蛋白胶作为骨髓间充质干细胞移植载体的体外相容性研究

[目的]构建骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)-生物蛋白胶复合体评价其生物相容性,探讨其作为种子细胞载体的可行性。[方法]本实验分为两组,实验组5×107骨髓间充质干细胞(BMSCs)与生物蛋白胶相混制备MSC-生物蛋白胶复合体,空白组骨髓间充质干细胞(BMSCs)。通过Dead/live染色观察两组的细胞形态及21 d内细胞的存活情况,同时分别在1、3、7、14 d各取上清进行Elisa检测并计算其分泌释放NGF和BDNF的浓度。[结果]实验组培养3 d后光镜下观察呈多个突起,细胞形态良好,空白组呈菱形和多角形;Dead/live染色结果提示体外培养1 d,两组细胞的存活率都在90%,比较无差异,无统计学意义(P﹥0.05),7、14、21 d两组细胞的存活率有差异,具统计学意义(P﹤0.05),存活率在60%以上;Elisa检测结果显示两组中NGF在1 d时有差异,具统计学意义(P﹤0.05),3、7、14 d时NGF和BDNF的含量比较无统计学意义(P﹥0.05),结果显示生物蛋白胶对MSC分泌的细胞因子NGF和BDNF的释放没有明显影响。[结论]生物蛋白胶是一种理想的可用于临床的细胞载体,具有良好的生物相容性,BMSCs-生物蛋白胶复合体能持续稳定的释放神经生长因子BDNF和NGF。     

骨髓基质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性及促轴突生长的体外功能实验

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)向雪旺细胞(SCs)分化的可行性,以及分化成类SCs的表型、分子及功能特征.方法 原代培养F344乳鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29、CD44、CD45的表达;诱导干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化,评价干细胞的生物学特性;采用碱性成纤维细胞生长因子和forskolin等诱导BMSCs向SCs分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定SCs特异性标记物S100和p75的表达;RT-PCR分析诱导前、后SCs相关基因的表达;培养大鼠背根神经节神经元,分别与诱导前后的BMSCs共培养,评价其促轴突生长的功能特性.结果 分离培养的鼠BMSCs CD29、CD44表达呈阳性,CD45表达呈阴性:干细胞诱导的成骨细胞茜素红染色阳性,脂肪细胞油红O染色阳性;BMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与SCs相似;免疫荧光染色S100和p75阳性;RT-PCR结果S100、CD104均表达增强;与背根神经节神经元共培养,诱导后的BMSCs促进轴突生长的距离为(285.3±36.7)μm,与未诱导组BMSCs的[(113.5±11.5)μm]相比,差异有统计学意义(t=8.966,P=0.001).结论 BMSCs可诱导分化成SCs,其表型、分子及功能特征与SCs相似,诱导分化的BMSCs是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

双向差速法制备高纯度雪旺细胞的实验研究

[目的]利用乳鼠的雪旺细胞与成纤维细胞贴壁及复合酶消化分离速度不同的特点,建立简单而快速提取和纯化雪旺细胞的方法。[方法]取3 d SD大鼠双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,剪碎后用0.2%复合胶原酶(Collagenase NB4)消化,细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶差速贴壁30 min,然后将细胞悬液移入一新的培养瓶培养48 h;用0.05%复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞,培养48 h后在相差显微镜下观察细胞形态;计数、纯度测定;免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度。[结果]经过2次纯化后,每25 cm2培养瓶可获取约(117.2±3.4)×104个细胞;第一轮纯化后雪旺细胞纯度达86.99%±1.53%,经2次纯化后纯度为98.32%±0.12%,两轮纯化之间有显著性差异,P<0.001;P75NTR免疫细胞化学鉴定细胞为阳性,流式细胞仪检测雪旺细胞纯度达97.9%。[结论]双向差速复合胶原酶消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法。     

激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的生物学特性评估

目的评估激素性股骨头坏死模型自体骨髓间充质干细胞增值能力及定向诱导能力。方法建立SD大鼠激素性股骨头坏死动物模型,行病理检查,验证模型。取模型组和对照组的骨髓间充质干细胞进行细胞生物学特性评估。结果联合运用牛血清和激素能够较好地建立激素性鼠股骨头缺血性坏死动物模型,激素性股骨头坏死SD大鼠的骨髓间充质干细胞,增值速率显著慢于对照组(P<0.05),其骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导后ALP染色阳性,但茜素红染色显示钙结节数量少于对照组,向成脂细胞定向诱后油红O染色示脂肪细胞少于对照组。结论实验组骨髓间充质干细胞仍具备干细胞的生物学特性,但相对于对照组其增殖能力减弱,成骨、成脂潜能减弱。     

化学去细胞异体神经添加不同组织来源雪旺细胞对周围神经损伤修复的功能评价

目的构建不同组织来源雪旺细胞(Schwann cells,SCs)及化学去细胞异体神经(chemically extracted acellular nerve allograft,CEANA)移植物,比较其修复周围神经缺损的效果。方法 4周龄SD大鼠3只,体重80～120g,体外培养、扩增和鉴定BMSCs及脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。体外诱导BMSCs和ADSCs分化为类雪旺细胞(dMSC,dADSC),并采用胶质细胞标记物p75和抗胶原纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)进行鉴定。取出生3d SD大鼠10只,体重6～8g,分离培养SCs。20只成年Wistar大鼠,体重200～250g,取双侧约20mm坐骨神经制备CEANA。40只成年雄性SD大鼠,制备左侧15mm坐骨神经缺损模型,根据神经缺损修复方法不同随机分为5组(n=8):A组,取自体坐骨神经翻转后吻合;B组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个SCs;C组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dMSC;D组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dADSC;E组,取15mm CEANA吻合。术后12周行感觉和运动功能恢复评价及组织学评价。结果 BMSCs和ADSCs表面抗原标志为CD34-、CD45-、CD90+。经诱导后BMSCs和ADSCs形态变化与SCs相似,呈双极、星形结构,SCs标记物p75和GFAP均表达阳性。术后12周,A、B、C、D、E组肢体50%回缩阈值分别为(13.8±2.3)、(15.4±6.5)、(16.9±5.3)、(16.3±3.5)和(20.0±5.3)g,A组与E组比较差异有统计学意义(P0.01),B、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。A、B、C、D、E组小腿三头肌收缩力恢复率分别为87.0%±9.7%、70.0%±6.6%、69.0%±6.7%、65.0%±9.8%和45.0%±12.1%,A、B、C、D组与E组比较差异有统计学意义(P0.05)。各组远端吻合口神经坚牢蓝染色显示神经纤维排列整齐,无炎性反应。甲苯胺蓝染色和透射电镜观察显示,B、C、D组有髓神经纤维计数及有髓神经纤维髓鞘厚度均大于E组,差异均有统计学意义(P0.01);B组轴突直径大于C、D组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 CEANA补充dADSC修复周围神经缺损与补充dMSC和SCs具有类似的修复效果。dADSC来源广泛,可作为组织工程神经理想的种子细胞,在复合CEANA修复周围神经缺损发挥重要作用。     

人脐带Wharton胶细胞外基质对软骨种子细胞的作用

目的 观察人脐带Wharton胶细胞外基质（hWJECM）对兔软骨细胞增殖的影响.方法用差速离心法制作hWJECM,制成0.5%浓度浆料分别铺于六孔细胞培养板和96孔细胞培养板上,形成1 mm厚的薄膜,包被有此膜的培养板作为试验组,未铺膜单纯培养液组作为空白对照组,在培养板上培养兔关节软骨细胞.通过倒置显微镜观察,甲苯胺蓝染色观察两个组的兔软骨细胞5,10,15天的生长形态和增殖情况,用CCK8细胞增殖实验比较两组的1、3、5、7 d的增殖情况,来评估软骨种子细胞的增殖和表型维持情况.结果倒置显微镜观察5、10、15 d的细胞增殖情况好于单纯培养液组,5、15 d的甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点,CCK8细胞增殖试验1,3天时试验组和对照组的增殖没有明显的统计学差异（P=0.7142; P=0.0657）,第5,7天显示hWJECM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组（P=0.0001;P=0.0006）.结论 hWJECM免疫原性低,无细胞毒性作用,能够很好地促进软骨细胞的增殖.     

胎儿对称性无眼喙鼻畸形超声所见1例

孕妇,27岁。孕1产0，孕29周。超声检查，双顶径6.6cm，头颅光环完整，脑中线居中，侧脑室饱满，宽约0.7cm，胎儿颜面部；眼水平纵横多切面探测，未见正常的眼眶、眼球、仅见浅凹状弧形高回声区（图1）     

人脐带Wharton胶间充质干细胞的生物学特性及雪旺细胞分化研究

[目的]研究人脐带Wharton胶间充质干细胞(WJMSCs)的生物学特性及向雪旺细胞诱导分化的可能性,为神经组织工程提供新的种子细胞.[方法]去除新鲜人脐带动、静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,采用组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,免疫荧光鉴定WJMSCs的细胞表面特异标记CD44,CD105,CD34,CD45,Stro-1,Vimentin和Nestin,评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和Forskolin等诱导WJMSCs向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物p75和GFAP的表达;Western分析诱导前后雪旺细胞特异性标记物GFAP的表达.[结果]分离培养的WJMSCs免疫荧光染色CD44、CD105、Stro-1和Vimentin表达阳性,而CD34、CD45和Nestin表达阴性,具有间充质干细胞的生物学特性;WJMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色p75和GFAP阳性;Western结果显示诱导的雪旺细胞标记物GFAP表达阳性.[结论]人脐带Wharton胶间充质干细胞可诱导分化成为雪旺样细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞.