基于耐药特性联合单细胞培养识别肝癌干细胞克隆亚群

目的:基于癌干细胞的耐药特性联合单细胞培养方法识别肝癌干细胞所在的克隆亚群.方法:以BEL-7404细胞系为研究对象,裸鼠体内移植瘤形成实验,并予阿霉素(adriamycin,ADM)8 mg/kg干预,待肿瘤直径为1.5 cm时取移植瘤细胞做原代培养,并在裸鼠体内连续传代4代,并将第4代移植瘤细胞命名为"BEL-7404-ADM-P4",根据成瘤时间检测肝癌干细胞富集情况.联合单细胞培养,取BEL-7404及BEL-7404-ADM-P4所形成的克隆根据克隆形态分为全克隆、部分克隆、旁克隆,检测BEL-7404及BEL-7404-ADM-P4单克隆中全克隆、部分克隆、旁克隆的癌干特性,即增殖能力、克隆形成率及悬浮球形成率;取其全克隆、部分克隆、旁克隆做hoechst33342染色,并在共聚焦显微镜下观察其染色情况;根据BEL-7404及BEL-7404-ADM-P4单克隆中全克隆、部分克隆、旁克隆的增殖能力、克隆形成率及悬浮球形成率以及hoechst33342染色情况识别癌干细胞所在的克隆亚群.结果:裸鼠体内低剂量阿霉素干预,在体内连续成瘤传代过程中,裸鼠皮下移植瘤成瘤率均为100%,且成瘤时间从第一代到第四代均有所缩短,以此达到了肝癌干细胞的初步富集;增殖能力:全克隆增殖速度最快,细胞量最大,部分克隆次之,旁克隆增殖速度最慢,并于第10天开始出现细胞皱缩死亡;克隆形成率:BEL-7404-ADM-P4-H高于BEL-7404及BEL-7404-ADM-P4-M,差异有统计学意义(P<0.05);悬浮球形成率:仅BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H可形成悬浮球,其余细胞系不形成悬浮球,而BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H悬浮球形成率比较,无统计学意义(P>0.05);BEL-7404及BEL-7404-ADM-P4单克隆中全克隆、部分克隆、旁克隆hoechst33342染色情况:BEL-7404及BEL-7404-A D M-P4单克隆中全克隆都有极少数不染和低染的细胞存在,但部分克隆、旁克隆全染,且BEL-7404单克隆中全克隆、部分克隆、旁克隆hoechst33342荧光强度均强于BEL-7404-ADM-P4单克隆中全克隆、部分克隆、旁克隆.结论:基于癌干细胞的耐药特性联合单细胞培养方法所形成的克隆亚群中,全克隆含有更高比例的肝癌干细胞.     

肝癌耐药细胞株的建立及癌干细胞的特性

目的建立肝癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立耐药BEL-7404人肝癌细胞株,并对亲代与耐药肝癌细胞株进行癌细胞基本特性、癌于细胞相关细胞学特性进行检测,用计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间与MTT法测耐药倍数;单个细胞成株培养、平板克隆形成实验、“球囊”细胞培养实验。结果耐药BEL-7404人肝癌细胞与亲本细胞相似,呈上皮样生长方式,但其中梭状细胞略多,耐药倍数为292倍;生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本BEL-7404人肝癌细胞,且倍增时间增加;耐药BEL-7404肝癌细胞克隆形成率、“球囊”细胞形成率均明显低于其亲本BEL-7404人肝癌细胞。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞株,但耐药肝癌细胞株的癌干细胞特征并不明显。     

《脾胃论》治未病思想探讨

《脾胃论》为中医脾胃内伤学说的重要著作,蕴藏丰富的治未病思想,值得研究。通过总结与探讨《脾胃论》中调理脾胃治未病的理论思想,认为应将保护脾胃元气置于首位,从脾胃调畅情志、用药顾护胃阳、存胃中津液,主张法于四时、食饮有节、避醉酒、起居有常、慎劳役、省语养神、加强平素防摄,从五行防治疾病等,以期更好地指导临床养生保健、防病延年。     

吴承艳治疗湿疹经验

从疾病的认识、辨证、用药论治三方面介绍吴承艳教授治疗湿疹的临证经验,认为风、寒、湿是湿疹的诱发因素,痰、热是该病的基本病理因素,辨证不仅在于辨风、湿、热之孰轻孰重,还在于辨体质而扶正、辨三焦而祛邪;治法以疏风、清热、祛湿、养血、脱敏为主,因人施治,分期论治,早期湿疹多用防风通圣散加减,中期血分有热宜清营汤加减,湿重于热宜三妙汤加减;慢性期则多用六味地黄丸加减;强调内外合治,重视平素调护是治疗湿疹之关键。文末举验案一则,以供思路借鉴。     

乌司他丁拮抗炎性因子致血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨乌司他丁(UTI)拮抗重度子痫前期血清及其肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对血管内皮细胞损伤的效应及机制,为UTI治疗重度子痫前期提供依据.方法 重度子痫前期孕妇10例,均留取血清冷藏备用.人脐静脉血管内皮细胞培养后分组:(1)空白对照组:不给予干预;(2)5％、10％、15％、20％血清组:血管内皮细胞中分别加入5％、10％、15％、20％重度子痫前期患者血清;(3)100U/ml、200 U/ml TNF-α组:在血管内皮细胞中分别加入100 U/ml、200 U/ml TNF-α;(4) UTI联合血清组(UTI+血清组):在20％血清组中分别加入50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml、1 000 U/mlUTI;(5) UTI联合TNF-α组(UTI+ TNF-α组):在200 U/ml TNF-α组中分别加入50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml和1 000 U/ml UTI.每组设6个复孔,分别干预12、24 h.采用噻唑蓝比色法检测血管内皮细胞增殖活性;采用流式细胞术检测血管内皮细胞凋亡及线粒体跨膜电位的变化.结果 (1)血管内皮细胞增殖活性:干预12 h、24 h时,15％、20％血清组OD值均低于空白组(P＜0.05);干预24 h时,100 U/ml TNF-α组、200 U/ml TNF-α组的OD值均低于空白组(P＜0.05).(2)血管内皮细胞凋亡:干预12 h、24 h时,20％血清组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均高于空白组(P＜0.05);干预24 h时,500 U/ml、1 000 U/ml UTI组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均低于20％血清组(P＜0.05).50 U/ml、100 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率与200 U/ml TNF-α组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率低于200 U/ml TNF-α组(P＜0.05).(3)血管内皮细胞线粒体跨膜电位:50 U/ml、100 U/ml UTI干预组的细胞凋亡率与20％血清组比较差异无统计学意义(P＞0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI组的细胞凋亡率低于20％血清组(P＜0.05);50 U/ml、100 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞凋亡率与200 U/ml TNF-α组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而500 U/ml、1000 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞凋亡率低于200 U/ml TNF-α组(P＜0.05).结论 乌司他丁可降低TNF-α和重度子痫前期患者血清导致的血管内皮细胞凋亡率,可能与其维持线粒体的跨膜电位平衡有关,提示UTI可作为拮抗妊娠期高血压疾病炎性反应的候选药物.     

拉曼光谱研究两面针活性成分诱导肝癌细胞的凋亡

运用拉曼光谱法对两面针活性成分诱导的肝癌细胞凋亡进行分析,肝癌细胞7404分别经10 mg·L~(-1)氯化两面针碱及3 g·L~(-1)两面针提取液处理后,收集经药液处理12,24,36,48 h的各组细胞的拉曼光谱后,通过Hochest33342/PI荧光染色法鉴定细胞并保留荧光染色阳性(发生凋亡活细胞)的光谱,并在Origin Pro8.0系统中比较各组平均光谱的差异。收集肝癌细胞的拉曼光谱依次进行背景扣除、平滑、归一化等方法处理。Hochest荧光染色后空白组细胞核染色均匀,而药物处理48 h后,核碎裂,拉曼光谱结果显示两面针提取液处理肝癌细胞12,24,36,48 h后,与核酸及蛋白质相关的峰均有降低,其中785,1 002,1 175,1 660 cm~(-1)峰强度随两面针药物作用时间的延长而降低,表明两面针活性成分能够诱导肝癌细胞凋亡,凋亡的肝癌细胞中核酸和蛋白质的含量均低于活细胞。两面针活性成分作用时间与药效呈一定的相关性。拉曼光谱能够反映中药两面针活性成分作用后的肝癌细胞内物质变化的信息,对实时监测细胞凋亡过程及药物的临床应用具有重要意义。     

舌癌耐药细胞株的建立及癌干细胞特性的实验观察

目的建立舌癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法以低浓度阿霉素持续增量诱导法建立TCA-8113舌癌耐药细胞株,并对亲代与舌癌耐药细胞株进行癌细胞基本特性、癌干细胞相关细胞学特性的检测,分别以计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间以及用MTT法测定耐药倍数,并进行单个细胞成克隆实验、平板克隆形成实验和悬浮球形成实验。结果TCA-8113舌癌耐药细胞为“铺路石”状上皮样生长方式,但其中异形细胞略多,耐药倍数为22倍;生长曲线提示其增殖速度明显低于亲本TCA-8113舌癌细胞,且倍增时间增加,但在细胞周期中各期细胞比例未见明显改变;TCA-8113舌癌耐药细胞克隆形成率、单个细胞培养成株率均明显低于其亲本TCA-8113舌癌细胞（P〈0．05）。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成舌癌耐药细胞株,但舌癌耐药细胞株的癌干细胞特征并不明显。