双色竞争性荧光定量PCR检测唐氏综合征

目的 建立一种快速检测唐氏综合征(Down syndrome,DS)的双色竞争性荧光定量聚合酶链反应(dual-color competitive quantitative fluorescent polymerase chain reaction,DCC-QF-PCR)方法,并探讨其应用于DS产前诊断的可能性.方法 提取30例DS患者和60名正常人的外周血DNA,设计DSCR和USC2两基因的特异共用引物和双色特异性TaqMan探针,同一反应管中进行两基因的DCC-QF-PCR,并与DSCR和GAPDH两基因的QF-PCR实验结果进行比较.提取46份羊水胎儿细胞的DNA进行DSCR和USC2两基因的DCC-QF-PCR,并与染色体核型分析结果对比;克隆出DSCR和USC2的单克隆基因片段,定量后进行定量配比的DCC-QF-PCR,并计算DSCR∶USC2拷贝数的比值.结果 DCC-QF-PCR检测中,DS患者DSCR∶USC2拷贝数比值范围为1.41～1.74,显著高于正常人的0.93～1.15;而QF-PCR检测中,DSCR∶GAPDH拷贝数比值范围较DSCR∶USC2增大.46份羊水检测中,3份DSCR∶USC2拷贝数比值分别为1.61、1.64和1.54,为DS患儿,其余43份正常,与染色体核型分析结果一致;DSCR与USC2基因定量配比的DCC-QF-PCR所得DSCR∶USC2拷贝数比值范围与配比值差异无统计学意义(P＞0.05),检测结果较为稳定.结论 DCC-QF-PCR具有准确、快速、需模板量少和费用低廉等特点,该方法在DS的基因诊断和产前基因诊断中有较为广泛的应用前景.     

女性A型血友病FⅧ基因突变分析

报道罕见的女性A型血友病1例,并对其凝血因子Ⅶ进行基因突变分析。患者,女,65岁,因为跌倒后右胸痛2d入院,院内查体提示胸壁皮下血肿,双下肢等长,髋屈曲及内旋受限。测定凝血指标提示APTT61．3s,正常血浆纠正后为41．3s,而PT、FIB、TT均正常。有既往出血史。FⅧ活性为2％,FⅨ活性为200％,vWF：Ag为120％,vWF：RCof100％,vWF：CBAl28％,FⅧ结合分析正常;髋关节X片提示;双侧髋臼发育不良,髋关节骨关节炎。临床诊断为血友病A型。提取该患者外周血DNA,根据NM_000132之凝血因子FⅦ基因序列设计合成了其第14外显子特异的引物,行聚合酶链反应扩增,并对扩增产物进行测序分析,测序结果与标准序列进行比较,发现该患者出现4111A→C杂合突变,使1314位氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸,产生一错意突变,该突变未见其它文献报道．     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的：构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达，探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法：实验于2004-8／12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板，反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因，经测序验证后，亚克隆至穿梭质粒pAdTrack CMV中，与骨架质粒pAdEasy 1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增，利用AdEasy 1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达，并用病毒上清转化大鼠神经干细胞，检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果：①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸，同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆，转染293细胞包装后的病毒滴度为lxl09PFU／mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论：成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

临床病案讨论

1 病历摘要 患者,女,25岁,未婚,因停经3个月,外院清宫并阴道大出血一天于2004年12月3日入院.患者平素月经规律,末次月经2004年9月4日,停经40天后有恶心、择食等早孕反应,停经2个月时上述反应消失,并出现阴道出血现象.2004年12月2日就诊城关镇医院,B超显示:子宫增大,宫颈及宫腔内异常回声.疑为"不全流产",遂行清宫,术中吸头未吸出组织,改用卵圆钳夹出一块约2 cm×3 cm大小组织,即开始大出血.停止操作,组织送检(结果未汇报),并用2把卵圆钳钳夹宫旁组织,静滴缩宫素,输血600ml后急转我院.既往体健,月经史16(4～5)/(28/30)量中等,无痛经史.     

人内皮抑素重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用Adeasy1系统,构建并鉴定人内皮抑素(hES)重组腺病毒。方法:从真核表达载体pEGFP-N1-ASP-hES中将ASP-hES扩增,亚克隆至pAdTrackCMV穿梭质粒中,与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达。结果:重组腺病毒载体经PCR鉴定正确,病毒滴度为1×108PFU/ml。结论:成功构建了人内皮抑素重组腺病毒Ad-ASP-hES,为内皮抑素基因治疗新生血管的进一步研究奠定了基础。     

金花茶不同部位多糖的测定及体外抗氧化活性

目的:测定金花茶不同部位的多糖含量并探讨其体外抗氧化活性的差异。方法:运用超声提取方法提取金花茶叶子、芽尖、果壳、花的多糖,采用苯酚-硫酸比色法测定多糖的含量,通过2,2’-联氮-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)检测法、邻苯三酚法和邻二氮菲法检测金花茶叶子、芽尖、果壳和花水提物的抗氧化能力,应用综合评分法,对各水提物的体外抗氧化活性进行综合评价。结果:金花茶花、叶、芽尖、果壳中多糖含量分别为32.88,29.48,35.89,30.02 g·kg-1;清除ABTS+自由基能力抗坏血酸(0.100 g·L-1)>花(0.135 g·L-1)>果壳(0.165 g·L-1)>芽尖(0.243 g·L-1)>叶(0.330 g·L-1);清除DPPH自由基能力顺序为抗坏血酸(0.200 g·L-1)>花(0.344 g·L-1)>果壳(0.435 g·L-1)>芽尖(0.881 g·L-1)>叶(1.011 g·L-1);超氧阴离子自由基抑制率抗坏血酸(0.2 g·L-1)≥芽尖(25.0 g·L-1)>果壳(25.0 g·L-1)>花(25.0 g·L-1)>叶(25.0 g·L-1);当生药浓度达到25.0 g·L-1时,花、芽尖、果壳对羟基自由基消除率均大于50%,但均小于抗坏血酸(2 g·L-1);综合评分为芽尖(55.05)>花(52.79)>果壳(51.97)>叶(23.73)。结论:苯酚-硫酸比色法测定金花茶不同部位的多糖含量稳定可行,金花茶水提物具有一定抗氧化能力且不同部位抗氧化能力存在明显的差异。     

短发夹RNA／MDR1逆转肝细胞癌多药耐药

有关RNA干扰（RNAi）逆转肿瘤多药耐药的实验研究报道较多,但绝大多数为细胞水平的体外实验。有报道将小RNA（siRNA）直接体内注射成功抑制目的基因表达…,但由于siRNA的不稳定性以及直接注射后的表达效率低下等问题,其可靠性值得商讨。我们在体外研究的基础上,探讨多药耐药基因（MDRI）的dsRNA质粒表达载体（PSUPER—shR-NA／MDR1）体内转染抑制多药耐药基因MDR1／p—gp表达的可能性。     

短发夹RNA/mdr1表达载体的构建及体外表达

目的构建短发夹RNA(shRNA)/mdr1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法按照pSUPER的设计要求合成mdr1基因RNAi靶序列的64 bp寡核苷酸序列,退火后双酶切法(BglⅡ和HindⅢ)克隆,得到质粒pSUPER-shRNA/mdr1,转染感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,测序证实后扩增培养并提取,然后转染融合达90%以上的HepG2/mdr1细胞,阴性载体为对照组,实时聚合酶链反应(Real—time PCR)、流式细胞术检测mdr1基因mRNA、P-gP表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER-shRNA/mdr1,基因测序证实靶序列插入正确; HepG2/mdr1-si组mdr1基因的mRNA表达水平是耐药株HepG2/mdr1组的56分之一;HepG2/mdr1-si组细胞和阴性对照组HepG2/mdr1细胞的P-gp表达率分别为11.0%和98.6%,P<0.05; HepG2/mdr1组细胞耐药倍数从62.5下降到1.4,相对逆转效率99.34%;细胞内DNR累积量也明显增加,与对照组比较(79.32%比37.96%),P<0.05。结论多药耐药基因mdr1质粒表达载体pSU- PER-shRNA/mdr1能在HepG2/mdr1内稳定表达,并逆转其耐药性。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,与骨架质粒pAdEasy1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸,同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.