一种新假定的解旋酶RuvBL1的抗凋亡活性研究

目的:探索解旋酶RuvBL1与细胞凋亡之间的关系。方法:构建RuvBL1真核表达重组质粒,采用磷酸钙法转染L929细胞进行瞬时表达,通过转化生长因子(TNF)α和放线菌素D诱导细胞凋亡,检测RuvBL1蛋白对凋亡的影响。结果:质粒构建后酶切得到约1.8kb长的片断,与RuvBL1的全长基因大小一致;转染L929细胞,可表达出相对分子质量为55000的蛋白,与理论值相同。RuvBL1组细胞凋亡率为40%,而对照组为70%;RuvBL1的抗凋亡活性呈剂量依赖性。结论:RuvBL1具有很好的抗凋亡活性,这一发现可能为凋亡相关疾病的治疗提供新的靶点。     

维生素D受体核定位信号的鉴定

目的：确定维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的核定位信号并验证其功能。方法：通过软件分析及文献调研预测VDR核定位信号,利用点突变试剂盒构建了VDR一系列点突变体,通过蛋白质免疫印迹检测VDR在胞质和胞核里的分布,并结合免疫荧光观察确定其预测突变点对VDR入核的影响,最后采用实时荧光定量链式聚合酶反应(quantitative real?time PCR,qPCR)检测 VDR 下游基因的表达,以判断 VDR 核定位突变体的活性。结果：确定 VDR 核定位信号序列为 49RRSMKRKALFLT61,构建的VDR一系列核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)点突变体在细胞内的表达主要分布在胞质里,维生素D(vitamin D,VD)既不能诱导这些点突变体入核,也不能促进VD下游基因表达。结论：VDR核定位确定信号能有效控制VDR进入细胞核发挥转录因子作用,进而影响其下游基因的表达,为探索VD及VDR相关疾病的治疗提供新平台和思路。     

TBK1对NLRC4炎症小体的作用及其机制研究

目的：探究TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1,TBK1）调控核苷结合寡聚化结构域样受体4（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 4,NLRC4）炎症小体激活的作用及其机制。方法：在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium, S.T）感染的永生化骨髓巨噬细胞（immortalized bone marrow derived macrophage,IBMDM）中,Western blot检测NLRC4炎症小体激活及其下游分子半胱天冬蛋白酶1（cysteine aspartic acid specific protease 1,Caspase-1）和Gasdermin D（GSDMD）的剪切情况; 乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞培养基上清中乳酸脱氢酶的含量;蛋白质免疫共沉淀实验确定 TBK1 与 NLRC4的相互作用及其具体结构域;细胞免疫荧光实验确定TBK1与NLRC4的空间定位;GST pull-down实验确定TBK1与NLRC4是否存在直接相互作用;凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）寡聚化检测实验验证NLRC4 炎症小体组装。构建S.T感染C57BL/6小鼠动物模型,观察小鼠生存情况。涂板计数腹腔灌洗液和肺的细菌负荷量;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测腹腔灌洗液及血清中的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α和白细胞介素（interleukin,IL）-1β的含量;流式细胞术检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。结果：在S.T感染的IBMDM中,抑制TBK1可减弱NLRC4炎症小体激活,NLRC4磷酸化水平下降,Caspase-1与GSDMD的剪切减少;TBK1与NLRC4存在相互作用,TBK1的N端与NLRC4的NACHT 结构域相互作用;TBK1与NLRC4存在空间上的共定位;TBK1可以磷酸化NLRC4的Ser533位点。S.T动物模型实验显示,抑制 TBK1活性可以显著提高小鼠的生存率;减低小鼠腹腔灌洗液和肺中的细菌负荷量;降低血清以及腹腔灌洗液中的IL-1β、TNF-α 的表达水平;减少腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。结论：TBK1与NLRC4相互作用,磷酸化NLRC4 Ser533位点,促进NLRC4 炎症小体的激活,为治疗相关疾病提供理论依据和新的潜在靶点。     

维生素D及其受体对RIP1调控作用的研究

目的 探讨维生素D及其受体对受体相互作用蛋白(RIP)1表达的影响及其作用机制。方法 采用实时定量PCR和Western blot技术,检测维生素D刺激对RIP1的m RNA和蛋白表达水平的影响,采用免疫共沉淀的方法探讨维生素D及其受体对RIP1的调节机制。结果 维生素D及其受体能够显著降低RIP1的m RNA及蛋白水平表达,抑制HSP90与RIP1复合物的形成。结论 维生素D及其受体通过调节HSP90与RIP1的相互作用调控RIP1的表达,为维生素D及其受体抑制肿瘤的发生提供了新的理论依据。     

壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究

目的:研究壳聚糖纳米颗粒在体外和体内实验中的转染能力.方法:用亚硝酸钠降解壳聚糖的方法制得低分子质量壳聚糖,用zeta电位仪测定粒径、多分散度、zeta电位,并使用乌式黏度计法测定其相对分子质量;通过静电吸附复合绿色荧光蛋白表达质粒pIRES-eGFP(报告基因),采用琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合能力;用体外和体内基因转染实验,评价纳米颗粒的转染能力.结果:制得的壳聚糖粒径200～600nm,多分散度最好的达到0.005,zeta电位0.89mV,相对分子质量7.7×107 ,粒径250nm.体外对3T3细胞的转染实验显示,该壳聚糖具有一定的转染效率;体内对Balbc57/BL6小鼠的股四头肌肌肉的转染实验显示,肌肉组织中有大量绿色荧光蛋白的表达,并且在炎症部位尤为明显.结论:本研究制备的壳聚糖,能够在体外和体内均实现有效转染,为基因治疗提供了一种潜在的载体.     

岩藻多糖对炎症性肠病的作用及其机制

目的：探讨岩藻多糖抑制炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）的作用及其机制。方法：将小鼠随机分为实验组和对照组（每组5只）,实验组给予岩藻多糖灌胃2周,对照组给予饮用水灌胃2周,随后两组小鼠均自由饮用溶有葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt,DSS）的水溶液,构建IBD小鼠模型。检测小鼠体重、脾脏重量、结肠长度及重量,HE染色观察结肠组织病理变化,观察大便性状并评分;运用实时荧光定量PCR（real?time fluorescence quantitative PCR,qPCR）检测炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白的mRNA水平变化。结果：岩藻多糖处理的实验组小鼠肠炎相关指标显著优于对照组,炎症程度减弱。结论：岩藻多糖能够预防和抑制IBD的发生,为预防和治疗IBD提供新方法和依据。