大鼠肝tRNA^Ile基因的化学合成及克隆

应用基因工程技术，设计并化合成了编码大鼠肝异亮氨酸转移ＲＮＡ的基因。大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ基因由７７ｂｐｘ组成，。为了便于克隆与转录，在其５‘端添加了ＢａｍＨＩ，ＳｆｉＩ限制性内切酶位点及Ｔ７启动子序一，３’端添加了ＳｓｔＮＩ及Ｈｉｎｄ酶切位点，基因全长由１２０ｂｐ，被克隆至Ｍ１３ｍｐ１８载体上，再用之转染Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。     

大鼠肝tRNA~(Ⅰle)基因的化学合成及克隆

应用基因工程技术，设计并化合成了编码大鼠肝异亮氨酸转移RNA(tRNA~(Ⅰle))的基因。大鼠肝tRNA~(Ⅰle)基因由77bp组成。为了便于克隆与转录，在其5＇端添加了BamHⅠ、SfiⅠ限制性内切酶位点及T7启动于序列，3＇端添加了BstNⅠ及HindⅡ酶切位点，基因全长为120bp，被克隆至M13mp18载体上，再用之转染E．coliJM109．用分子杂交、PCR及酶切分析筛选出阳性克隆，序列分析证实与所设计的基因完全一致。大鼠肝tRNA~(Ⅰle)基因合成与克隆的成功，为进一步tRNA~(Ⅰle)功能与构象的研究打下基础。     

胰岛素样生长因子Ⅰ基因化学合成及克隆筛选

胰岛素样生长因子(IGF)是存在于人血清和脑脊液中的含70个氨基酸的生长促进多肽,其结构与前胰岛素同源.IGF-1由肝脏产生,并伴有共同处于生长激素控制下的特殊IGF结合蛋白质.文献报导[1]IGF-1具有胰岛素样效力和刺激软骨的硫酸摄入效力,从而可提高细胞中蛋白质和DNA合成.     

胰岛素样生长因子基因化学合成及克隆筛选

胰岛素样生长因子(IGF)是存在于人血清和脑脊液中的含70个氨基酸的生长促进多肽,其结构与前胰岛素同源.IGF－1由肝脏产生,并伴有共同处于生长激素控制下的特殊IGF结合蛋白质.文献报导1IGF－1具有胰岛素样效力和刺激软骨的硫酸摄入效力,从而可提高细胞中蛋白质和DNA合成.实验证实IGF－1在100μg／kg的注射剂量下,可观察到明显的降血糖效应,因此它很有希望成为胰岛素替代物,用于治疗胰岛素抗性的病人.另外,IGF－1在极低浓度下能作为正常人体必需的细胞生长因子,在治疗侏儒症、肝硬化、原发性甲状腺机能衰退以及营养不良等疾病中…     

一种改进的大引物PCR定点诱变方法

目的 建立一种改进的、简便易行的大引物PCR定点诱变技术。方法 在两轮PCR中设计了两种不同的质粒DNA模板，两者分别缺少正向或反向外侧引物可结合的互补序列；当两种模板和两条外侧引物同时存在于一个反应管时，可以完全避免对野生型目的基因全长的扩增。第1轮PCR由正向外侧引物和突变引物合成大引物，这一产和无需凝胶纯化而直接用于第2轮PCR。第2轮PCR的第1阶段由大引物延伸合成全长突变终产物，两条外侧引物则在第2阶段指数扩增，所有终产物均含所需致突变位点。结果 用此方法对中国人β地中海贫血15种稀少突变类型进行定点诱变，并将诱变得到的全长人β珠蛋白基因克隆到pGEM－T载体后全长测序，所有克隆均鉴定为所需突变型。结论 这种改进的大引物PCR定点诱变技术省时、省工，诱变的成功率可达100％，适于实验室常规应用。