人G6PD在大肠埃希菌中的表达及体外抑制剂筛选模型的建立

目的 表达人6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)并建立其体外抑制剂筛选模型。方法 设计一对5′端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物,PCR扩增G6PD cDNA。将cDNA和质粒pET-28a经NdeⅠ+XhoⅠ酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌Top10。将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.4 mmol/L IPTG诱导G6PD表达,镍离子亲和层析柱纯化G6PD。以6-磷酸葡萄糖(G6P)和烟酰胺腺嘌呤核苷二磷酸(NADP+)为G6PD的底物和辅因子,检测340 nm波长处光吸收值(A₃₄₀)的变化,确定G6PD及其抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)的最佳浓度,计算模型的可靠性指数—Z′因子。结果 构建了重组质粒pET-28a-G6PD,重组菌BL21(DE3)-pET-28a-G6PD经IPTG诱导后,可溶性G6PD表达量为2.5 mg/L,G6PD、DHEA的最适浓度分别为900μg/L、20μmol/L,筛选模型的Z′因子为0.88。结论 在大肠杆菌中表达了有活性的G6PD,建立了可靠的体外抑制剂筛选模型。     

上槽缓冲容量不足导致双向电泳纵向拖尾原因初探

目的 探讨上槽缓冲容量对双向电泳纵向拖尾的影响.方法 保持上槽缓冲液体积不变,分别采用1×buffer电泳2块或1块SDS胶,或1.5×、2×、3×buffer电泳2块胶,比较纵向拖尾情况.结果 1×buffer电泳2块胶,整块胶出现严重纵向拖尾,电泳1块胶时无纵向拖尾.1.5×buffer电泳2块胶,纵向拖尾只存在于...     

唾液Histatin 5突变体在巴斯德毕赤酵母中的优化表达

目的通过优化重组毕赤酵母GS115-pPICZα-A-HRP5′表达条件,提高表达水平,增强产物抗菌活性。方法将培养基甘油含量、pH、诱导前培养时间、甲醇诱导量、诱导后培养时间设置不同梯度,采用琼脂孔穴扩散法比较各梯度下表达产物抗菌活性。结果以pH6.0、甘油含量2.0%YEPG培养基、培养30h后用1.5%甲醇诱导培养48h,表达产物抗菌活性最高。结论优化条件为HRP5′的大规模发酵奠定了基础。     

优化盐酸浓度、水解时间和氢氧化钠量改善糖原含量鉴定效果

目的 优化盐酸浓度、水解时间和氢氧化钠量,改善糖原含量鉴定效果.方法 用不同浓度的盐酸水解糖原5 min、终浓度2mol/L盐酸水解糖原不同时间的产物分别与碘液反应,通过红褐色深浅探索最佳盐酸浓度和糖原完全水解所需时间;用不同量的氢氧化钠中和糖原水解液中的盐酸,比较中和后的水解产物与班氏试剂反应的氧化亚铜颜色深浅,探索...     

唾液HRP5第17位密码子反义突变对其在毕赤酵母中表达的影响

目的 在毕赤酵母中表达唾液富组蛋白5(HRP5)基因原始序列hrp5及突变序列hrp5'(Lys17→Asn),比较表达量及抗白色念珠菌活性.方法 选用毕赤酵母偏爱密码子,设计3'端互补、5'端带酶切位点的两对引物,PCR合成hrp5和hrp5',克隆至pPICZα-A,转化大肠杆菌,将酶切、测序鉴定的阳性重组质粒pPICZα-A-hrp5和pPICZα-A-hrp5'经Sac I线性化后电击转化GS115,筛选阳性菌落,PCR鉴定,甲醇诱导表达,比较抗菌活性,测定表达量.结果 hrp5及hrp 5'正确整合到GS115基因组中,突变前后表达产物与HRP5标准品活性相当,表达量分别为4μmol/L、5μmol/L.结论 HRP5在毕赤酵母中成功表达,活性区Lys17突变为Asn使表达量提高25%,而对其杀菌活性无影响.     

醋酸和刀片铁锈对银染蛋白质脱色的影响

目的 探讨银染蛋白质脱色失败的原因.方法 比较有无醋酸、不同切胶工具的脱色效果,并检测刀片有无铁锈.结果 用手术刀片切碎凝胶时,洗去凝胶中的醋酸,脱色成功,不洗醋酸,脱色失败;用塑料吸头捣碎凝胶,脱色成功;刀片有铁锈存在.结论 醋酸和刀片铁锈是导致银染蛋白质脱色失败的原因.     

唾液富组蛋白5克隆载体的构建

目的将唾液富组蛋白5(histatin5)的cDNA克隆至T载体,获取大量酶切后的目的片段。方法选用大肠杆菌偏爱密码子编码histatin 5氨基酸,设计5′端带酶切位点、3′端互补的两条引物,通过overlap PCR获取histatin 5的cDNA,将cDNA与T载体连接后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,PCR、酶切、测序鉴定。酶切重组T载体,获取目的片段。结果Histatin 5的cDNA正确克隆至T载体,无突变。结论克隆载体构建成功,有利于目的片段的酶切和回收。     

唾液富组蛋白5表达载体的构建

目的将唾液富组蛋白5cDNA克隆至表达载体pGEX-4T-1。方法EcoR I＋Sal I双酶切克隆载体pMD19-T-hrp5及pGEX-4T-1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX-4T-1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX-4T-1，无突变。结论重组载体pGEX-4T-1-hrp5构建成功。