MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建pCDNA3.0-MIIP真核表达载体并建立其稳定转染的MDA-MB-231细胞系。方法pGEX-4T-1-MIIP重组质粒及pCDNA3.0真核表达载体分别经Xho I和EcoR I双酶切后,回收目的基因,T4 DNA连接酶连接后,转化得到pCDNA3.0-MIIP重组真核表达载体,对其进行双酶切和测序鉴定。脂质体法将鉴定后的pCDNA3.0-MIIP质粒转染至人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别于转染后48和72h提取细胞总RNA,QRT-PCR法确定其转染。G418筛选转染细胞,Western blot检测目的蛋白表达。结果酶切及测序结果证实pc DNA3.0-MIIP真核表达载体构建成功。pcDNA3.0-MIIP转染至MDA-MB-231细胞后,QRT-PCR检测证实MIIP表达显著增强。G418筛选后得到单克隆细胞群,Western blot检测证实MIIP表达显著增强。结论成功构建出了可在真核细胞中高效表达MIIP基因的pc DNA3.0-MIIP重组质粒;建立了稳定过表达MIIP的MDA-MB-231细胞系。     

博卡病毒MVC对MDCK细胞的感染能力分析

【立论依据】 犬亚型博卡病毒MVC属于细小病毒家族成员。病毒能够在不同的物种及生物体间发生种属间的感染和疾病传播,关于博卡病毒在不同物种间的传播和感染方面的报道甚少。实验指导教师在前期研究发现,博卡病毒MVC的感染性克隆载体能够在一些非犬来源的细胞系中进行DNA的复制并形成完整具有感染能力的病毒颗粒,但是MVC并不能感染这些细胞系。MVC能否感染犬来源的MDCK细胞系,其感染能力如何?这就是我们实验设计的出发点。 【设计思路】 用犬来源WRD细胞(MVC的嗜性细胞,感染的阳性对照)和MDCK细胞系作为感染对象,采用不同感染滴度MVC与2种细胞孵育,用免疫荧光技术、RT-PCR观察细胞中是否有病毒基因表达;采用MTT法观察细胞增殖能力的变化,依此确认MVC对MDCK细胞的感染能力。 【实验内容】 (1)Real-time PCR技术检测胞中MVC病毒基因mRNA的表达:WRD细胞、MDCK细胞铺60 mm培养皿之后与MVC病毒孵育1 h后,换培养液并继续培养24 h,提取细胞RNA并进行PCR检测;(2)免疫荧光技术检测细胞中MVC病毒蛋白的表达:细胞在6孔培养板中(底部覆盖载玻片)进行细胞爬片之后,与MVC病毒孵育1 h后,换培养液继续培养24 h,通过免疫荧光技术检测MVC病毒蛋白的表达;(3)MTT法观察受感染细胞增殖及活力水平:细胞铺96孔培养皿后与不同MVC病毒滴度孵育1 h后,换培养液继续培养72 h,通过MTT法观察受感染细胞增殖及活力水平。 【材料】 WRD、MDCK细胞系、博卡病毒MVC、靶向病毒蛋白的抗体是实验室的基本储备材料;需要RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR引物、荧光二抗、MTT检测试剂盒及其他常用试剂等均可从生物试剂公司购买或合成;实验室拥有PCR仪、酶标仪、荧光显微镜等实验所需的主要仪器。 【可行性】 病毒能够在不同的物种及生物体间进行感染和疾病传播是本实验设计的理论前提;指导教师前期的研究成果,为本实验设计提供了充分的、扎实的理论根据和支持。 【创新性】 研究博卡病毒MVC对非嗜性细胞系MDCK的感染能力。实验内容迄今国内未见相关报道,在国际上亦处前沿研究,具有创新性。