转基因显微注射的剂量控制与效果分析

为了分析转基因显微注射的注射剂量对胚胎发育效果的影响，用尖端直径为0.5～1.0um的显微注射针在不同气压和不同时间的条件下进行微注射测试，并对133枚小鼠受精卵分别注射不同剂量，观察注射后胚胎发充情况。实验采用的气压电控式显微注射器，具有注射时间短(msec)，注射的可控性和可重复性好的特点，在相同条件下重复注射时，误差小于0.004pl。结果表明．小鼠受精卵原核内注射剂量在2～4pl时．胚胎体外发育不受影响，当大于10pl时，胚胎在注射后1h内全部死亡．也证明了注射针尖端直径小于1．0um时，导致细胞损伤和影响胚胎发育的主要因素是注射剂量的大小。因此，对于小鼠肛胎原核内注射剂量2-4pl是较为合适的“安全剂量”.     

一种胚胎移植新方法的建立

在转基因动物制作中胚胎移植是一个关键性技术。胚胎的输卵管移植相比子宫移植来说,可以避免在体外较长时间培养,但从输卵管伞部移植卵又常常不可避免地因囊膜开口而不同程度的出血,而且由于伞口部位置较隐蔽,移卵时技术难度大要求高。因此．我们尝试在囊膜外靠近壶腹部附近开口于输卵管,将卵直接移入壶腹部,卵移行至子宫发育。此技术非常简单易行,有助于提高转基因动物的制作效率。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

不同条件下培养小鼠胚胎干细胞

胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞 )是从早期胚胎中分离出来的全能细胞系[1,2 ] 。当将这种细胞注入受体胚胎时 ,能参加各种组织器官的发育 ,形成嵌合体而后杂交至纯合体。通过ＥＳ细胞进行基因打靶[3 ] ,将外源基因定点整合产生基因剔除或基因修复从而制备转基因动物模型 ,故ＥＳ细胞可以用于研究基因的结构、功能及调控、医学疾病模型建立以及生殖细胞基因治疗等研究。利用ＥＳ细胞可以研究哺乳动物的分化和发育等基本问题 ,还可以通过研究ＥＳ细胞在体外定向诱导为特殊组织类型细胞为将来临床提供器官组织的原材…     

绿色荧光蛋白基因gfp真核表达载体pcT K GFP的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ） 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建提供基因材料。方法：采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＥＧＰＣ１ 中扩增出ｇｆｐ（７９９ ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＸｂａⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＴＫ,重组质粒ｐｃＴＫＧＦＰ用限制性内切酶和ＤＮＡ序列分析进行鉴定。结果：部分ＤＮＡ 序列分析证明ＰＣＲ产物为ｇｆｐ,成功筛选到携带ｇｆｐ 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ。结论：ｐｃＴＫＧＦＰ真核表达载体的构建,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建奠定了基础。