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目的 用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性.方法 常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的 片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定.纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况.结果 成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80 μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05).结论 成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础. 相似文献
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目的探讨人体应用重组结核杆菌11kDa变态反应原(简称11kDa)的安全性和最适剂量。方法将健康志愿者和结核病志愿者按照双盲法随机分为11kDa低、中、高3个剂量组,在一侧手前臂掌侧前1,3处皮内分别注射浓度为2μg/ml、5μg/ml和10μg,/ml11kDalml.在对侧手前臂前1/3处皮内注射0.1mlTB—PPD.进行同体双臂对照皮肤试验,观察并记录72h内局部或全身不良反应情况和皮试局部反应。结果11kDa低、中、高剂量组和TB—PPD组均无严重不良反应。局部不良反应发生率分别为2.7%、1.2%、5.5%和5.7%,组间差异无统计学意义(P〉0.05);健康志愿者皮试阴性率分别为86.0%、68.1%、62.8%和54.1%,11kDa低剂量组阴性率高于中、高剂量组和TB—PPD组差异有统计学意义(P〈0.05或P〈0.01),但中、高剂量组和TB—PPD组之间差异无统计学意义(P〉0.05);结核病患者皮试阳性率分别为56.7%、66.7%、83.3%和81.7%,11kDa低、中剂量组间阳性率比较差异无统计学意义(P〉0.05)。1lkDa高剂量组和TB~PPD组阳性率组间差异无统计学意义(P〉0.05),但该两组的阳性率显著高于11kDa低剂量组差异有统计学意义(P〈0.05或P〈0.01。结论11kDa在结核病诊断上优于PPD,11kDa3个剂量和TB—PPD均有很好的安全性.其中高剂量组(10.0μg/ml)与TB—PPD阳性检出率相近。 相似文献
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BCG是公认的结核病预防疫苗,但其保护力从0%~80%不等,因而印度德里大学南校的Khera等分别以pAK3和pAK4为载体制备了6种表达结核杆菌(MTB)ESAT-6蛋白(E6)、α晶体蛋白(αcry)或超氧化物歧化酶(sod)的DNA疫苗(pAK3-E6、pAK4-E6、pAK3-αcry、pAK4-αcry、pAK3-sod和pAK4-sod),并评估了疫苗诱导小鼠体液和细胞免疫应答的能力及对MTB感染豚鼠的保护效力。分别用100μg pAK3-E6、pAK4-E6、pAK3-αcry、pAK4-αcry、pAK3-sod、pAK4-sod、pAK3或pAK4肌肉免疫Balb/c小鼠,每3周1次,共免疫3次。末次免疫后3周检测免疫小鼠的特异… 相似文献
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目的 探讨我国结核病新疫苗评价用卡介苗参考体系对豚鼠的保护力。 方法 采用我国卡介苗(D2 PB 302)菌株制备的疫苗,以1/10人用剂量(0.005 mg/0.2 ml)经皮下注射免疫豚鼠,对照组等体积注射生理盐水。共进行4个实验,免疫与感染间隔分别为:实验Ⅰ与Ⅱ免疫后进行Mtb感染的时间间隔为5周(其中实验Ⅱ为实验Ⅰ的重复实验,实验Ⅰ中BCG组和对照组均入组8只豚鼠;实验Ⅱ中BCG组入组6只豚鼠,对照组入组8只豚鼠),实验Ⅲ为28周(BCG组入组5只豚鼠,对照组入组6只豚鼠),实验Ⅳ为60周(BCG组和对照组均入组8只豚鼠),感染剂量为每只豚鼠2×(102~103)CFU Mtb/ml,注射0.5 ml,感染途径为皮下注射,感染后6周,进行豚鼠解剖,观察豚鼠肝脾肺的病变程度并进行脾脏Mtb的分离,计算脾脏Mtb分离数和对数值。 结果(1) BCG免疫5周组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为10.0±3.8,较对照组(46.9±4.8)差异有显著统计学意义(t=-0.63, P<0.01);脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为0.49±0.49,较对照组(5.41±0.18)差异有显著统计学意义(t=-9.43, P<0.01)。(2)BCG免疫5周重复实验组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为6.7±2.1,较对照组(36.3±6.0)差异有显著统计学意义(t=-4.63, P<0.01);脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为0.38±0.38,较对照组(5.11±0.19)差异有显著统计学意义(t=-11.22, P<0.01)。(3)BCG免疫28周组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为10.0±4.5,较对照组(57.5±6.2)差异有显著统计学意义(t=-6.24, P<0.01);脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为2.16±0.93,较对照组(5.44±0.27)差异有统计学意义(t=-3.39, P<0.05)。(4)BCG免疫60周组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为14.4±4.8,较对照组(56.9±5.0)差异有显著统计学意义(t=-6.16, P<0.01);脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为1.46±0.69,较对照组(5.43±0.20)差异有显著统计学意义(t=-5.55, P<0.01)。 结论 卡介苗保护力评价参考体系可靠稳定,我国临床应用卡介苗在该体系呈现优良保护效果。 相似文献
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目的评价重组结核分枝杆菌11kDa(相对分子质量为11 000)蛋白(简称"重组11kDa蛋白")在潜伏性结核感染筛查和卡介苗接种鉴别中的应用。方法由首都医科大学附属北京胸科医院联合北京市昌平区结核病防治所、北京市怀柔区结核病防治所和北京市大兴区结核病防治所,于2014年7月至2016年3月在以上3个区的高校和工厂招募健康志愿者。共计招募3001名志愿者,所有志愿者体检合格,均签订知情同意书。对所有志愿者采用Mantoux法进行重组11kDa蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1ml重组11kDa蛋白(10μg/ml)和0.1ml TB-PPD(50U/ml),观察注射后72h后的皮肤反应。于皮肤试验前采集所有志愿者的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测。采用"一致率(%)"和"一阶一致性系数(the first-order agreement coefficient,AC1)比较重组11kDa蛋白皮肤试验、TB-PPD试验及IGRA结果的差异。3001名志愿者均接受3种方法检测,其中475名3种检测结果均为阴性的受试者,... 相似文献
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Objective To study the immune function of mice immunized by different combinations of antigen 85b ( Ag85b), fusion protein culture filtered protein 10 ( CFP-10), early secreted antigenic target 6 kDa protein (ESAT-6) and heat shock protein X (Hsp X) with combined adjuvants of Bacille CalmetteGuerin (BCG) CpG and aluminum.Methods According to antigen combinations, 48 BALB/c mice were divided into 8 groups: ( 1 ) group A: Ag85b + CFP-10/ESAT-6 + HspX + adjuvant; (2) group B: CFP-10/ESAT-6 + HspX + adjuvant; ( 3 ) group C: Ag85b + HspX + adjuvant; (4) group D: Ag85b + CFP-10/ESAT-6 + adjuvant; (5) group E: Ag85b + adjuvant; (6) group F: CFP-10/ESAT-6 +adjuvant; (7)group G: HspX + adjuvants; (8) control group: saline (6 mice per group).The mice were subcutaneously immunized 3 times.One week after the third subcutaneous immunization, spleens were collected for enzymelinked immunospot (ELISPOT) assay to detect IFN-γ and IL-4 secretion, and for the lymphocyte proliferation assay to observe antigen-specific lymphocyte proliferation.Serum samples were separated for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the titers of antigen-specific IgG, IgG1 and IgG2a antibodies.Results The amount of IFN-γ spots in Group E [median ( quartile), 122.8 (78.4 - 184.4 )]was significantly more than that in group C [14.3 (6.5 - 14.6)] and the control group [0.5 (0.5 - 1.3)](u =0.0, P < 0.01 ).The amount of IL-4 spots in Group D stimulated with Ag85b and CFP-10/ESAT-6 [173.5 (78.8 -233.4), 132.8 ( 50.3 - 159.4)] were significantly more than those in the control group [0.5 (0.5 - 1.3 ), 5.3 ( 2.9 - 6.5 )] ( u = 0.0, P < 0.01 ).The level of stimulation index of lymphocyte proliferation in Group A, C, D, E(2.42 ±0.50, 2.18 ±0.37, 2.86 ±0.51, 2.70 ±0.15) was significantly higher than that of the control group ( 1.11 ± 0.13 ) ( F= 20.96, P < 0.01 ).The level of antigen-specific IgG, IgG1 , IgG2a antibody titers induced by Hsp X [lg( antibody dilution degree), 3.90 -5.21] was significantly higher than those induced by Ag85b (3.30-4.51 ) and CFP-10/ESAT-6 (3.10 -4.05) ( F = 63.8 - 70.4, P < 0.01 ) .Conclusions With the use of adjuvants, different antigen combinations showed different influences on the immune function in mice.A combination of 3 antigens did not elicit the best immune effect, suggesting that the interaction among antigens may affect their immunity. 相似文献