病毒滴度和插入子长度对慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响

目的 研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响.方法 制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体,通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠,然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率,并对所生成的数据进行统计学分析.结果 插入子长度在较短(＜2 kb)的情况下,病毒滴度达到2×108就可获得较高的整合率,在插入子长度稍长(4～5 kb)的情况下,需要1×109滴度才能获得较高的整合率,而在插入子长度大于6 kb的情况下,未能用该方法获得转基因小鼠.结论 滴度的增加能有效提高慢病毒载体制备转基因小鼠的整合率,而当滴度适中(～2×108)时,整合率随插入子长度的增加而下降.     

应用双色荧光原位杂交技术对转基因小鼠进行整合位点的染色体定位

目的 建立一种高度灵敏、特异的双色荧光原位杂交(dual-color fluorescence in situ hybridization,D-FISH)技术,对两种双阳性转基因小鼠外源基因进行整合位点的染色体定位.方法 对一只整合单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk)/增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,eGFP)的转基因小鼠以及两只整合RNA干扰载体(RNA interference,RNAi)的β654地中海贫血模型小鼠进行实验,脾脏细胞经培养后获得中期分裂相标本片,各加入适量生物素、地高辛标记探针混合液杂交,分别用罗丹明红色荧光抗体及FFIE绿色荧光抗体进行D-FISH检测.结果 两种转基因小鼠均能在同一个分裂相上同时检测到双色荧光信号.其中,HSV-tk/eGFP双阳性小鼠的分裂相上出现较强的绿色HSV-tk信号和红色eGFP信号,分别定位于染色体2E5-G3及8A2-A4;β654/RNAi双阳性小鼠检测到红色β654荧光信号及绿色RNAi荧光信号.经定位分析,β654均整合在染色体7D3-E2,RNAi病毒载体则是随机整合,其中一只鼠主要整合在1281位点,而另一只鼠主要整合在染色体1E2.3-1F、3A3两个位点.结论 用自行制备的DNA探针建立了高度灵敏、特异的D-FISH技术,同时结合G显带对双阳性转基因小鼠进行染色体基因定位.该技术平台的建立对于转基因动物和基因治疗动物模型的研究具有非常重要的意义.