蓬乱蛋白2 干扰和过表达慢病毒载体的构建 及其在hUVECs 中的表达

目的 获得蓬乱蛋白2（DVL2）基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中（hUVECs） 稳定表达。方法 ①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2 干扰 和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和测序技术鉴定载体构建是否成功;② 以3 质粒系统在HEK293T 细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转 染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC 组（hUVECs 空白对照）、NC 组（HBLV-GFP-PURO 阴性对照）、干扰组（pHB-shRNA-HDVL2）及过表达组（pHBLV-HDVL2）。③通过 qRT-PCR 与Western blotting 检测分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果 ①插 入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。②病毒包装 后,NC 组、干扰组、过表达组滴度分别为2×108、2×108 和1×108 TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率 达98%。③干扰组DVL2 的表达较BC 组降低,差异有统计学意义（P <0.05）,过表达组较BC 组升高,差异有统 计学意义（P <0.05）,其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC 组的2.7 倍。结论 DVL2 基因干扰和过表 达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs 中稳定表达。     

缺氧对细胞膜ABCA1降解的影响及其机制研究

摘要：目的  探讨缺氧对细胞膜三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）降解的影响及其与钙蛋白酶的相关机制。方法  肝X受体激动剂TO-901317刺激RAW264.7细胞24 h,实时定量聚合酶链反应检测ABCA1 mRNA表达水平。生物素标记法提取细胞膜蛋白,Western blot检测细胞膜ABCA1蛋白水平表达。Western blot检测在放线菌酮存在或不存在条件下,TO-901317干预的RAW264.7细胞经过12 h缺氧（1%氧气O2）处理后细胞膜ABCA1蛋白水平,Suc-LLVY-氨基虫荧光素法检测缺氧细胞内钙蛋白酶活性。RAW264.7细胞给予钙蛋白酶抑制剂ALLN干预,检测细胞膜ABCA1蛋白表达及钙蛋白酶活性。结果  TO-901317上调ABCA1 mRNA及细胞膜蛋白水平表达。无论放线菌酮存在或不存在情况下,缺氧均能降低细胞膜ABCA1蛋白水平,升高钙蛋白酶活性。钙蛋白酶抑制剂ALLN能部分逆转缺氧诱导细胞膜ABCA1蛋白水平降低。结论  缺氧可能通过增加钙蛋白酶活性,从而加速细胞膜ABCA1蛋白降解。