蛋白C p.Ala333Thr突变引起遗传性蛋白C缺陷症的分子机制

目的：探讨蛋白C（PC）p.Ala333Thr突变导致遗传性蛋白C缺陷症（IPCD）的分子机制。方法：使用氨基酸多序列比对工具T-Coffee评估突变氨基酸位点的保守性,使用突变有害性评分工具PolyPhen-2预测突变对PC结构和功能的危害性。利用定点突变试剂盒QuickMutationTM构建PC基因（PROC ）野生型和p.Ala333Thr突变型质粒,并瞬时转染入HEK-293T细胞进行体外表达,RT-qPCR检测突变PC转录24 h后的mRNA水平变化,利用蛋白印迹法（Western blot）和ELISA分别检测突变PC胞内外水平变化,并对细胞内质网、高尔基体PC进行免疫荧光染色,初步探讨p.Ala333Thr突变导致IPCD的分子机制。结果：多序列比对结果显示PC的Ala333位点保守性不高,PolyPhen-2对PROC 的p.Ala333Thr突变评分为0.763。成功转染野生型与p.Ala333Thr突变型PROC 质粒后,突变型PROC 转录水平无明显变化;Western blot结果显示,突变型PROC的PC表达量明显下降;免疫荧光染色结果显示,野生型PC在内质网和高尔基体均有大量分布,而p.Ala333Thr突变型PC主要分布于内质网。结论：PROC p.Ala333Thr突变可能导致了PC的错误折叠和加工障碍,造成胞外PC表达量下降,最终引起了IPCD的发生。