Notch信号通路基因JAG1、ADAM17和ADAM10与先天性心脏病(CHD)的相关性

 目的  探索Notch通路的配体JAG1和限速酶ADAM10和ADAM17与先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)发病的相关性。方法  选取来自山东、上海两地的1 053例CHD患者血液样本和1 000例对照样本,对这3个基因的5′启动子区和3′-UTR区进行了全测序,并进行统计分析及简要功能验证。结果  检测到7个SNP (含2个新发SNP位点Ch2:9695908T/C和Ch20:10655928T/C)和1个单倍型组合具有显著性频率差异。双荧光素酶报告基因试验表明其中ADAM17启动子区的rs3811592M rs13415726M rs3811591M这个连锁单倍型可显著下调基因表达;而JAG1启动子区的rs7264849M则可显著上调基因表达。结论  这些SNP突变可能影响Notch信号的强弱,从而与心脏发育异常相关。     

转座子piggyBac介导的HSV-tk基因在妇科恶性肿瘤细胞中长期稳定表达的研究

目的 研究piggyBac(PB)转座子介导转移外源基因HSV-tk在多种妇科恶性肿瘤细胞中的表达情况,探讨其作为一种可整合的非病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用价值.方法 通过PCR技术扩增HSV-tk基因的编码区,定向克隆至PB表达载体PB[Act-RFP]DS,经酶切、测序鉴定为重组载体PB[Act-RFP,HSV-tk]DS(pPB/TK).联合3种小同的转染试剂FuGENE HD、jetPEI及lipofectamine 2000,分别将pPB/TK转染入4种常见的妇科恶性肿瘤细胞株HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B.转染后以mRFP1为报告基因,经荧光显微镜观察和流式细胞仪分析转染效率;逆转录(RT)-PCR技术检测HSV-tk和mRFP1基因的表达;四甲基偶氮唑蓝实验测定不同浓度的更昔洛韦(GCV)对转染后细胞的杀伤作用.转染后细胞经流式细胞仪分选,极限稀释单克隆培养建立稳定转染株,并以反向PCR技术确定转座子插入基因组的位点.结果 (1)成功构建重组载体pPB/TK.(2)在3种转染试剂的辅助下,pPB/TK均可有效转染入HeLa、HEC-1B、SKOV3和JEG-3细胞;不同转染试剂辅助下pPB/TK在同种细胞中的转染效率各不相同,在HeLa细胞中,FuGENE HD的转染效率[(78.7±9.2)%]高于lipofectamine 2000[(54.1±11.4)%]和jetPEI][(46.5±7.4)%],分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);同一转染试剂辅助下pPB/TK在不同细胞中的转染效率也不相同,以FuGENE HD为转染试剂,pPB/TK在HeLa、JEG-3和SKOV3细胞中的转染效率分别为(78.7 ±9.2)%、(74.4±8.9)%和(83.2±9.7)%,高于HEC-1B细胞的(39.5±8.7)%,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)RT-PCR结果显示,4种细胞均有HSV-tk和mRFP1基因mRNA的表达.(4)GCV对转染有pPB/TK的HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B细胞的半数抑制浓度分别为1.29、3.35、0.09和13.28 μg/ml.10μg/ml GCV对转染有pPB/TK的SKOV3细胞抑制率高于单独转染pORF-HSVtk者,细胞抑制率分别为(86±9)%和(52±12)%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).(5)稳定转染株在转染后3个月仍可观察到mRFP1表达,并可榆测纠基因组中有TTAA位点的插入整合.结论 PB转座子可介导外源基因在多种妇科恶性肿瘤细胞中的长期稳定表达,有望为肿瘤基因治疗提供更为安全有效的转基因技术平台.     

MECP2基因甲基化和羟甲基化水平的性别差异研究

目的 探讨MECP2在不同性别脑组织中是否有表达差异,从而与孤独症等疾病的性别差异相关。方法 利用4例非疾病流产胎儿脑标本,采用酚氯仿方法提取基因组DNA。在MethPrimer在线软件上检测MECP2基因-1 000 bp至+1 200 bp区间的CpG 岛。甲基化检测采用亚硫酸氢盐修饰后测序法（使用EZ DNA Methylation-goldTM Kit 试剂盒）。对于超声断裂后的基因组DNA,用基因组羟甲基化试剂盒（diagenode,hMeDIP kit）进行ChIP反应。反转录cDNA采用FastQuant RT Kit（With gDNase）试剂盒,定量PCR检测MECP2表达量采用 SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）试剂盒。结果 标本1男,重量106 g,长度17.4 cm;标本2女,重量100 g,长度19.1 cm;标本3男,重量500 g,长度28.3 cm;标本4女,重量510 g,长度31.5 cm。MECP2表达量男性胚胎（标本1=0.0367,标本3=0.0155）高于女性胚胎（标本2=0.0177,标本4=0.0088）。MECP2的甲基化水平女性个体平均1条X染色体上MECP2的甲基化程度显著高于男性,特别是在启动子的核心区域-309 bp至-179 bp,男性MECP2上几乎没有甲基化,而羟甲基化水平男性高于女性。结论 男性MECP2基因的DNA修饰促进其表达,可能提高了男性胚胎对MECP2基因突变的易感性,从而影响MECP2基因突变导致的患病人群的性别差异。