抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 研究LIF/Stat3信号通路对小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化成心肌细胞的影响.方法 利用mESCs形成拟胚体(EBs)进行心肌分化.在野生型mESCs形成EBs的过程中加入Janus激酶(JAK)抑制剂以抑制LIF/Stat3信号通路(JAKi组).而在融合表达雌激素受体(ER)和Stat3的Stat3ER细胞株进行分化过程中添加4-羟基他莫西酚(4HT)以激活LIF/Stat3信号通路 (4HT组).用qRT-PCR检测心脏特异转录因子NKX25、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和连接蛋白43(Cx43)以及mESCs自我更新基因oct4、nanog和Stat3下游基因socs3的表达水平.用Western blot检测和免疫荧光染色法验证α-MHC和Cx43的相对表达.结果 免疫荧光结果显示在自发搏动的EBs中出现α-MHC和Cx43的荧光,表明心肌细胞分化成功.随着分化时间的延长,NKX2.5、α-MHC和Cx43的mRNA表达量逐渐增加,至第15天时最为明显,且JAKi组高于对照组(P<0.01);对照组高于4HT组(P<0.01).而nanog、oct4随着分化时间的延长逐渐降低,且JAKi组低于对照组(P<0.05),而4HT组高于其对照组(P<0.05).Socs3的表达量在JAKi组一直较低且低于对照组,在4HT组表达较高且高于对照组(P<0.01).Western blot检测结果显示第15天的Cx43和α-MHC蛋白表达量JAKi组明显高于对照组(P<0.05),4HT组低于其对照组(P<0.05).结论 抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞分化成心肌细胞;激活LIF/Stat3信号通路抑制小鼠胚胎干细胞的心肌细胞分化.     

CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

目的 观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化中的作用.方法 采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组.用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达.用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达.用Western blot法检测 α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达.结果 免疫荧光法提示各组mESCs能够向心肌细胞分化.在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加最为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01).Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组.结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进mESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a.