人TCA-12-2/TCB-7.1真核双表达载体的构建与表达

目的：将T细胞抗原受体基因TCA-12-2和TCB-7.1共同构建在真核表达载体pDC315，用于哺乳动物细胞293转染研究。方法： 将分离得到的淋巴细胞总RNA反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到TCA-12-2基因；以实验室保存含TCB-7.1基因的质粒为模板，扩增得到TCB-7.1基因。随后酶切，连入载体pIRES2-AcGFP1，通过亚克隆连入载体pDC315，得到重组质粒pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1。重组体质粒经酶切鉴定后，并对插入的TCA-12-2和TCB-7.1基因片段进行测序，将鉴定好的阳性重组质粒用脂质体介导转染293细胞，并通过RT-PCR和流式细胞仪检测TCA-12-2和TCB-7.1基因的表达情况。结果： TCA-12-2和TCB-7.1可以同时构建在载体pDC315上，RT-PCR和流式细胞仪检测发现TCA-12-2和TCB-7.1基因可以成功在293细胞上表达。结论：成功构建了含TCA-12-2和TCB-7.1基因的双表达载体。     

Hela细胞Survivin克隆及HLA-A2限制性CTL表位预测研究

目的：从Hela细胞中克隆凋亡抑制因子Survivin的编码序列,进行测序,并由此预测其HLA-A＊0201限制性CTL表位。方法：设计人Survivin基因序列特异引物,通过RT-PCR扩增Survivin编码序列,构建至pGEM-T载体后,测序分析,并对其进行了HLA-A＊0201限制性CTL表位抗原表位相关预测。结果：从Hela细胞中克隆得到的Survivin和Survivin-ΔEx3两种剪接体,其中Survivin-ΔEx3发生1个同义突变和三个错义突变,预测其抗原表位抗原性发生了变化。结论：寻找抗原性强、结合力高的表位,对于今后抗肿瘤多肽疫苗的研究具有重要的意义。     

淋巴细胞活性检测方法研究

目的 探讨淋巴细胞活性检测最佳方法,以提高检测灵敏度和稳定性,降低本底.方法 用传统的实验方法和改进的实验方法分别对不同数量的外周血单核细胞进行检测,比较不同实验方法的准确性、灵敏度和稳定性.结果 在不吸除培养基的情况下,传统的DMSO和酸性异丙醇都不能完全融解formazan,影响了检测.传统的酸性SDS能够很好的融解formazan,但是得到的OD值太小,这就降低了检测的灵敏度,容易造成测量误差,而改进的10%SDS溶液能够完全融解formazan,并且得到的OD值适中,能够客观的反应细胞数目的变化,减少数值引起的实验误差.结论 用改进10%SDS作为溶解formazan的溶解液,可以准确地反应活细胞的数目变化情况,对淋巴细胞这类悬浮细胞来说.在不吸除上清的情况下进行细胞数目的检测更加方便.     

肿瘤患者偏移的T细胞TCRBV表达谱在自体CIK细胞中的恢复

目的 研究肿瘤患者自体PBMC经体外诱导培养的CIK细胞群TCRBV亚家族表达的变化.方法 Ficoll密度梯度离心法分类人体外周血单核细胞(PBMC),经IFN-γ、OKT-3以及IL-2诱导培养,Trizol试剂提取总RNA,RT-PCR半定量分析24个TCRBV亚家族表达情况,流式分选平台分选CD3+ CD8+细胞和CD3+ CD56+细胞亚群.结果 诱导培养后的CIK中,分化的CD3+ CD56+细胞亚群比例占12.6％～41.7％.PBMC中弱表达或缺失的TCRBV亚家族,在CIK中上调或恢复表达.CIK细胞群中,CD3+CD8+细胞和CD3+ CD56+细胞亚群克隆组成无明显差异.结论 肿瘤患者自体PBMC体外诱导培养CIK细胞后,部分表达偏移的TCRBV亚家族能恢复表达,表明部分受损或被抑制的T细胞克隆在CIK培养中被激活并增殖.     

5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析

 目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析。方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响。结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+ T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响。结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性。     

重组SARS-CoV S1蛋白抗原表位分析及抗原性检测

目的对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike,S)S1段进行原核重组表达,并检测表达产物的抗原性。方法对S1中的HLA抗原表位进行预测分析,根据分析结果选定用于重组表达的区段,利用pET21b载体进行原核表达,将产物纯化后利用SARS抗血清进行抗原性检测。结果抗原表位分析表明,S1中包含有多个能够被HLA分子有效提呈的抗原表位,综合考虑表位肽的分布、重组表达的效率、重组蛋白的空间构象以及引物设计的优化等因素,选取S1中的关键区域259~565 aa进行原核重组表达,得到了包涵体形式的重组蛋白,经过纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性S1蛋白;用SARS抗血清对此重组蛋白进行免疫学鉴定,表明该蛋白具有SARS特异的抗原性。结论重组表达的S1蛋白具有较强的抗原性,为进一步的疫苗研究和抗体筛选奠定了基础。     

Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的 探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果.方法 利用Survivin启动子替换pEGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体pSurP-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在pSurP-EGFP中,构建成重组载体pSurP-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡.结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果.结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果.