外周血循环肿瘤DNA检测方法及应用

肿瘤是一种威胁人类健康的重大疾病。研究发现,肿瘤的发生和发展是基于分子水平上癌基因(oncogenes)的激活和抑癌基因(anti-oncogene)的失活所致。基因突变分析对于肿瘤诊断和预后至关重要。早期诊断被认为是提高癌症病人治愈率,降低其死亡率最有效的途径。外周血循环肿瘤核酸中可检测到与肿瘤细胞一致的基因突变。这些基因突变的检测可以为肿瘤的分期及药物的治疗疗效和预后提供丰富的信息。因此,外周血循环肿瘤DNA突变检测为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的研究方向和领域。     

黑色素瘤抗原基因MAGE-A3 5′端CpG岛异常甲基化检测

目的研究黑色素瘤抗原基因MAGE-A3 5′端CpG岛异常甲基化状态,探讨其作为肝细胞肝癌(HCC)肿瘤标志物的可行性。方法利用重亚硫酸盐测序聚合酶链反应(BSP)分析HCC细胞株HepG2和健康对照者来源白细胞基因组中MAGE-A3基因5′端CpG岛异常甲基化状态,寻找HCC细胞MAGE-A3 5′端CpG岛去甲基化位点。结果 HepG2细胞和健康对照者来源白细胞基因组MAGE-A3 5′端CpG岛存在不同的甲基化状态,前者存在特异性去甲基化位点。结论 MAGE-A3 5′端CpG岛去甲基化位点的检测可用于HCC的早期诊断。     

普伐他汀治疗AMI急诊PCI术后CHF患者血浆NT-proBNP和MMP-2的变化及与左室重构的关系

目的 观察他汀类药物普伐他汀对急性心肌梗死(AMI)急诊经皮冠状动脉介入术(PCI)后较为稳定的慢性心力衰竭(CHF)患者氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和左室重构的影响及相关性.方法 96例AMI急诊PCI术后CHF患者(NYHA分级Ⅱ/Ⅲ)随机分为普伐他汀20 mg组(普伐他汀20 mg/d治疗,n=52)和普伐他汀40 mg组(普伐他汀40 mg/d治疗,n=44),比较两组治疗前一般资料、两组治疗前和治疗18个月后血浆NT-proBNP和MMP-2水平以及左室重构相关指标的变化,并分析其相关性.结果 两组治疗后血浆NT-proBNP和MMP-2水平均较治疗前显著降低(P<0.05),治疗后普伐他汀40 mg组血浆NT-proBNP和MMP-2水平显著低于普伐他汀20 mg组(P<0.05).普伐他汀治疗后,两组左室质量指数(LVMI)、左室舒张末期内径(LVEDD)、舒张末左室后壁厚度(LVPWT)较治疗前均显著降低(P<0.01),普伐他汀40 mg组LVMI、LVEDD、LVPWT显著小于普伐他汀20 mg组(P<0.01);两组舒张末室间隔厚度(IVST)、左室短轴缩短率(FS)、左室平均周径缩短率(MVCF)、二尖瓣口多普勒舒张早期最大流速与舒张末期最大流速比率(E/A)较治疗前均显著增加(P<0.01),普伐他汀40 mg组IVST、FS、MVCF、E/A显著大于普伐他汀20 mg组(P<0.01).两组治疗前后血浆NT-proBNP和MMP-2的下降水平均与LVMI、LVEDD、LVPWT减少呈正相关,均与IVST、FS、MVCF、E/A增加呈负相关;NT-proBNP、MMP-2下降水平两者呈正相关(均P<0.05).结论 他汀类药物普伐他汀对AMI急诊PCI术后较为稳定的CHF患者心功能改善有益,这可能与其抑制MMP-2、减轻左室重构作用相关.     

AMI紧急PCI治疗后非梗死相关动脉不同治疗策略对血炎症因子和主要心血管事件的影响

目的 研究急性心肌梗死(AMI)多支血管病变急诊经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后非梗死相关动脉采用药物或药物+PCI治疗后的血炎症因子[可溶性CD40配体(sCD40L)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]和主要心血管事件(MACE)发生率.方法 入选2007-08～2008-05接受PCI治疗的50例AMI多支病变患者,根据对非梗死相关动脉是否再次PCI将患者分为两组,其中PCI治疗组20例(40%),药物治疗组30例(60%).对比分析治疗12个月时两组sCD40L、IL-6、TNF-α水平的变化和MACE发生率及其相关性.结果 ①两组性别、年龄、病因构成比、冠心病易患因素、心功能分级、肝肾功能指标、治疗用药、植入支架类型、血管病变支数、病变类型、完全闭塞病变的比例比较差异无统计学意义(P均>0.05).②两组治疗前sCD40L、IL-6、TNF-α水平比较差异无统计学意义,治疗后两组sCD40L、IL-6、TNF-α水平均下降(P均＜0.01),而治疗后两组sCD40L、IL-6、TNF-α水平比较差异无统计学意义(P均＞0.05).③PCI治疗组心绞痛复发率、再次因心源性疾病入院率明显低于药物治疗组(P均＜0.01),但继发心力衰竭、再次非致命性心肌梗死、靶血管再次血管化、严重心律失常、全因死亡及心源性死亡率等两组比较差异无统计学意义(P均＞0.05).④两组炎症因子水平下降差值与MACE发生率呈负相关(P均＜0.01).结论 AMI后非梗死相关动脉采取PCI治疗较单纯药物治疗减少了心绞痛复发率、再次因心源性疾病入院率,但并不减少MACE发生率.     

^3H—花生四烯酸参入大肠杆菌膜检测细胞内外磷脂酶A2活性

目的 建立一种用同一底物检测分泌型磷脂酶A2（sPLA2)和胞浆型磷脂酶A2（cPLA2)的放射化学方法。方法 用^3H-花生四烯酸参入大肠杆菌膜,在一定条件下被待测PLA2水解,以水解率的大小表示酶活性的高低。结果 测定cPLA2和sPLA2反应体系中最适pH值分别是7．8和8．0,最适钙离子浓度是5和13mmol/L;cPLA2批内5．2％,批间CV10．9％,sPLA2则分别是4．9％和7．8％;倍比稀释实验结果具有良好的线性关系;急性胆囊炎患者血清sPLA2活性明显高于正常人,内毒素（LPS）诱导前后白血病K562细胞内和培养液中PLA2活性差异有显著性（P＜0．05）。结论 建立的检测法可满意临床和科研要求。     

苦参碱对内毒素致炎大鼠PLA2活性影响及其抗炎机制研究

目的研究苦参碱抗炎机制和其抑制磷脂酶A2(PLA2)活性的作用.方法用[3H]花生四烯酸掺入大肠杆菌膜为底物检测细胞内外PLA2方法,测定了苦参碱对内毒素(LPS)造成的大鼠急性内毒素炎症时血清中分泌型磷脂酶A2(sPLA2)活性和外周血白细胞中胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)活性的影响,同时用Fura2-AM作荧光指示剂检测胞内游离Ca2+浓度的变化,并通过大鼠足跖肿胀实验证实苦参碱的抗炎作用.结果在LPS介导的急性内毒素血症大鼠,30 mg/miL的苦参碱0.2 mLip 1 h对外周血sPLA2抑制效果最好,抑制率达(81.9±1.8)%,此时胞内cPLA2活性抑制率是(28.4±6.0)%,而Ca2+浓度是(157.10±20.56)nmol/L,比对照升高1 5.3%.足跖肿胀实验亦证明苦参碱对炎症有显著抑制作用.结论苦参碱是一种具有抗炎作用的新型PLA2抑制剂.     

~3H-花生四烯酸参入大肠杆菌膜检测细胞内外磷脂酶A_2活性

目的　建立一种用同一底物检测分泌型磷脂酶A2 (sPLA2 )和胞浆型磷脂酶A2 (cPLA2 )的放射化学方法。方法　用3 H 花生四烯酸参入大肠杆菌膜 ,在一定条件下被待测PLA2 水解 ,以水解率的大小表示酶活性的高低。结果　测定cPLA2 和sPLA2 反应体系中最适pH值分别是 7.8和 8 0 ,最适钙离子浓度是 5和 13mmol/L ;cPLA2 批内CV 5 .2 % ,批间CV 10 .9% ,sPLA2 则分别是 4.9%和 7.8% ;倍比稀释实验结果具有良好的线性关系 ;急性胆囊炎患者血清sPLA2 活性明显高于正常人 ,内毒素 (LPS)诱导前后白血病K5 62细胞内和培养液中PLA2 活性差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论建立的检测法可满足临床和科研要求     

普伐他汀治疗AMI急诊PCI术后CHF患者血浆NT-proBNP和MMP-2的变化及与左室重构的关系

目的观察他汀类药物普伐他汀对急性心肌梗死（AMI）急诊经皮冠状动脉介入术（PCI）后较为稳定的慢性心力衰竭（CHF）患者氨基末端脑钠肽前体（NT—proBNP）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和左室重构的影响及相关性。方法96例AMI急诊PCI术后CHF患者（NYHA分级II／III）随机分为普伐他汀20mg组（普伐他汀20nag／d治疗,n=52）和普伐他汀40mg组（普伐他汀40mg／d治疗,n=44）,比较两组治疗前一般资料、两组治疗前和治疗18个月后血浆NT—proBNP和MMP-2水平以及左室重构相关指标的变化,并分析其相关性。结果两组治疗后血浆NT—proBNP和MMP-2水平均较治疗前显著降低（P〈0．05）,治疗后普伐他汀40mg组血浆NT—proBNP和MMP-2水平显著低于普伐他汀20mg组（P〈0．05）。普伐他汀治疗后,两组左室质量指数（LVMI）、左室舒张末期内径（LVEDD）、舒张末左室后壁厚度（LVPWT）较治疗前均显著降低（P〈0．01）,普伐他汀40mg组LVMI、LVEDD、LvPwT显著小于普伐他汀20mg组（P〈0．01）;两组舒张末室间隔厚度（IVST）、左室短轴缩短率（FS）、左室平均周径缩短率（MVCF）、二尖瓣口多普勒舒张早期最大流速与舒张末期最大流速比率（E／A）较治疗前均显著增加（P〈0．01）,普伐他汀40mg组IVST、FS、MVCF、E／A显著大于普伐他汀20mg组（P〈0．01）。两组治疗前后血浆NT—proBNP和MMP-2的下降水平均与LVMI、LVEDD、LVPWT减少呈正相关,均与IVST、FS、MVCF、E／A增加呈负相关;NT—proBNP、MMP-2下降水平两者呈正相关（均P〈0．05）。结论他汀类药物普伐他汀对AMI急诊PCI术后较为稳定的CHF患者心功能改善有益,这可能与其抑制MMP-2、减轻左室重构作用相关。     

外周血循环肿瘤DNA检测方法及应用

肿瘤是一种威胁人类健康的重大疾病.研究发现,肿瘤的发生和发展是基于分子水平上癌基因(oncogenes)的激活和抑癌基因(anti-oncogene)的失活所致.基因突变分析对于肿瘤诊断和预后至关重要.早期诊断被认为是提高癌症病人治愈率,降低其死亡率最有效的途径.外周血循环肿瘤核酸中可检测到与肿瘤细胞一致的基因突变.这些基因突变的检测可以为肿瘤的分期及药物的治疗疗效和预后提供丰富的信息.因此,外周血循环肿瘤DNA突变检测为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的研究方向和领域.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立

近期，表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，并已成为肿瘤早期诊断的研究热点。甲基化特异性PCR（MSP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，该方法灵敏度和特异度高，但操作繁琐，难以自动化。TaqMan荧光定量PCR法，即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针，该方法的准确性和检测的灵敏度都很高。然而，因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限，而且TaqMan探针昂贵。本研究建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR（FQ—PCR）检测DNA甲基化的方法，通过临床标本检测和对比试验，以证明其与Methylight的检测效能，以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具。