结核分枝杆菌Mtb81蛋白的表达及应用研究

目的克隆结核分枝杆菌Mtb81蛋白的编码基因Rv1837c,并在大肠杆菌中表达、纯化,获得重组蛋白Mtb81。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1837c基因序列,克隆入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组Mtb81。ELISA检测重组Mtb81蛋白的敏感性和特异性。结果重组质粒pETRv1837c测序表明具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白Mtb81在大肠杆菌中以包涵体和可溶性形式稳定表达。以Mtb81为抗原ELISA检测结核病患者血清抗体总敏感性为20.83%,特异性为95.83%。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

TB16.3重组蛋白在结核感染中的诊断价值研究

目的 通过构建结核分枝杆菌蛋白TB16.3的原核表达载体并表达纯化,对其检测抗体的性能进行评价.方法用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA扩增TB16.3基因,连接到表达载体PET-30a上,在大肠杆菌中表达:组氨酸标签镍柱层析纯化重组蛋白.结果 建立ELISA方法检测116份TB患者和96份健康对照者血清中的抗结核菌TB16.3抗体.构建了表达TB16.3的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶形式存在.诱导剂IPTG浓度为1 mmol/L.37℃培养5h可获得最大量表达.而在28℃时重组蛋白为可溶形式表达.用重组TB16.3蛋白,ELISA方法检测118份TB患者和96份健康者血清,敏感性、特异性和调整一致率分别为72.9％、86.5％和79.6％.抗TB15.3抗体的敏感性、特异性和调整一致率分别为46.6％、99.0％和76.0％.抗CFP-10的敏感性、特异性和调整一致率分别为75.4％、55.2％和65.7％.结核病患者抗Rv2626C抗体阳性率(44.1％)显著低于其在正常对照的阳性率(75.0％,x2=20.8,P＜0.01).TB15.3和TB16.3等量包被检测,敏感性、特异性和一致率分别达69.4％、96.9％和83.7％,检测非TB肺部疾病患者,其抗体阳性率仅为9.6％,特异性为90.4％.TB15.3和TB16.3混合后同时包被检测,结合TB15.3单独检测的结果,则敏感性、特异性和一致率分别达82.2％、95.9％和88.9％,一致率为最高.结论 目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,获得制备上述4种蛋白的最适条件.获得的重组TB16.3、CFP 10和TB15.3蛋白可能成为结核病血清学诊断的抗原或者抗原组合.Rv2626C抗体可能被用于结核患者恢复期的评估.