利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

GANT61通过自噬性细胞死亡抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖

 目的 观察Hedgehog通路抑制剂GANT61对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用。方法 GANT61作用MCF-7细胞后,通过流式细胞术检测细胞死亡;提取处理细胞总RNA和蛋白。分别采用Real-timePCR和Western blot检测Hedgehog通路SHH、Gli1、Gli2及自噬标志物LC3-Ⅱ表达;处理细胞固定后通过电子显微镜观察GANT61诱导的自噬体形态;自噬抑制剂3-MA处理细胞或自噬相关基因atg5 siRNA转染细胞后再用GANT61作用,流式细胞术检测细胞死亡数量。结果 GANT61能明显诱导MCF-7死亡,降低Hedgehog通路SHH、Gli1、Gli2表达水平,提高LC3-Ⅱ蛋白表达,并可诱导MCF-7细胞产生自噬体。3-MA及atg5 siRNA可减弱GANT61诱导的细胞死亡。结论 GANT61通过诱导自噬性细胞死亡机制发挥抗乳腺癌细胞活性。