中国汉族人群TRAIL基因多态性的研究

目的 探讨中国汉族人群中TRAIL基因的分布情况及其在相关疾病发生中的作用.方法 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术,对265例中国汉族人TRAIL基因第5外显子3′-非编码区1595位点(以mRNA为标准)进行检测,分析基因型频率和等位基因频率在不同性别人群中的分布.结果 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验显示,本组各等位基因频率期望值和观察值无显著差异,且其基因多态性分布无性别差异,与日本人相比无显著差异(P>0.05),等位基因频率与非洲及美洲高加索人相比均有显著差异(P<0.05).结论 PCR-RFLP方法 检测TRAIL基因型特异性高,成熟、稳定;中国汉族人群TRAIL基因第5外显子3′-非编码区1595位点存在C/T突变.     

PDCD5通过Wnt/β-catenin通路抑制肾细胞癌侵袭转移及其机制研究

目的探讨肾细胞癌(RCC)患者PDCD5的表达水平及其参与调控RCC侵袭与转移的可能机制。方法利用免疫组化检测RCC标本与癌旁组织中PDCD5的蛋白表达水平,同时分析PDCD5与疾病分期、预后的相关性;利用transwell及划痕实验检测PDCD5对肾癌细胞系A498侵袭与转移的影响;利用Western blot检测A498细胞转染PDCD5后MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin及Wnt/β-catenin通路的变化。结果 (1)与癌旁组织相比,RCC标本中PDCD5明显下调(P0.001),且与疾病分期及预后正相关;(2)PDCD5明显抑制了肾癌细胞系A498的转移与侵袭能力(P0.01);(3)PDCD5通过抑制A498细胞系中MMP2、MMP9及N-cadherin的表达水平,增强E-cadherin的表达水平调控EMT转化,同时Wnt/β-catenin通路关键蛋白下调。结论 PDCD5通过调控Wnt/β-catenin通路影响肾细胞癌EMT转化,负性调控了RCC病人的侵袭与转移进程。     

乙肝病毒核心蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建2种包含乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的真核表达载体,检测其在人肝癌细胞系BEL7402中的表达.方法 以质粒pUC19/3.0HBV作为模板,PCR扩增HBc基因,分别以pcDNA3.0和pEGFP-N1为母本,构建含HBc基因的真核表达载体pcDNA-HBc-HA及pEGFP-HBc.通过单、双酶切、PCR及DNA测序鉴定其正确性.利用脂质体将其分别转染入人肝癌细胞系BEL7402,并采用RT-PCR、Western blot及荧光显微镜观察的方法,分别检测其mRNA、蛋白质水平的表达.结果 获得与预期分子量大小一致的DNA片段,转染2种质粒的BEL7402细胞均可高水平表达HBc mRNA,而空载体转染组则无表达,转染pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组,均有较强的绿色荧光表达,pcDNA-HBc-HA转染组细胞可检测到HBc-HA融合蛋白的表达.结论 成功构建2种携栽HBc基因的真核表达载体,并可在人肝癌细胞系BEL7402中有效表达.     

TNFAIP8(TIPE)抑制 p53 蛋白乙酰化促进宫颈癌增殖机制研究

目的:TIPE 蛋白在肿瘤发生发展中起重要作用,但目前为止其在宫颈癌中的表达情况及潜在生物学功能还 未见报道,本研究旨在探讨TIPE 在宫颈癌中的表达水平及对宫颈癌细胞生物学功能的影响和可能机制。方法:免疫组化检 测宫颈癌组织及癌旁组织中TIPE 的表达,分析表达水平与患者预后的相关性;细胞实验检测TIPE 对Siha 细胞增殖影响; Western blot 实验初步探讨其可能的分子机制。结果:宫颈癌组织中TIPE 表达水平较癌旁组织明显上调,且与预后负相关;细 胞实验发现其促进宫颈癌细胞系Siha 的增殖;机制研究发现TIPE 抑制p53 乙酰化,从而抑制其下游分子p21 的表达。结论: TIPE 在宫颈癌组织中表达上调,且通过抑制p53 乙酰化促进宫颈癌细胞增殖,提示其参与了宫颈癌的发生发展进程。     

稳定高表达小鼠Tim-4巨噬细胞系RAW264.7-T4的建立

目的建立研究小鼠Tim-4功能的细胞模型。方法常规分离小鼠腹腔巨噬细胞，RT-PCR扩增Tim-4全长基因片段，构建含Tim-4全基因片段的真核表达载体pcDNA3.0-Tim-4, 通过BamHⅠ、HindⅢ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pcDNA3.0和pcDNA3.0-Tim-4分别转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7，通过G418加压筛选，建立稳定高表达Tim-4的RAW264.7，并采用RT-PCR、流式细胞术和免疫细胞化学染色法检测Tim-4 mRNA和蛋白的表达水平。结果RT-PCR扩增产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切，与pcDNA3.0连接构建的重组体经酶切和测序，结果与GenBank报道序列一致。RT-PCR结果显示，RAW264.7 T4细胞表达Tim-4 mRNA的水平显著高于对照组，流式细胞术显示RAW264.7-T4高水平表达Tim-4蛋白，免疫细胞化学染色表明Tim-4主要表达于胞膜。结论成功构建了携载小鼠Tim-4全基因的表达载体，并用该重组体建立了稳定高表达Tim-4 mRNA和蛋白的小鼠巨噬细胞系，为进一步探讨Tim-1与Tim-4的相互作用及对免疫细胞功能的影响奠定基础。     

乙型肝炎病毒核心蛋白小干扰RNA载体的构建与验证

目的 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并验证其干扰效果.方法 设计针对HBV基因组（ayw亚型）HBc基因的小干扰RNA序列（位于2147 bp ～2165 bp序列）,目的片段与载体成功连接后转入大肠埃希菌DH5α,酶切及测序验证其正确性.最后以脂质体转入HepG2.2.15细胞中,检测其干扰效果.结果 成功构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并命名为pshRNA-HBc..酶切及测序验证正确,pshRNA-HBc对HepG2.2.15细胞中HBc表达具有特异性干扰效果.结论 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,为后续研究HBc的生物学功能奠定良好基础.     

TRAIL基因启动子区单核苷酸多态性与脂肪肝的相关性

目的探讨中国山东汉族人群肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体（Tumor necrosis factor(TNF) related apoptosis inducing ligand, TRAIL）基因启动子区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与脂肪肝（FLD）的相关性。方法采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性（PCR RFLP）分析和四引物法聚合酶链反应（Tetra primer ARMS PCR）的方法检测了42例非酒精性脂肪肝、67例酒精性脂肪肝和132例健康对照者的TRAIL基因启动子区单核苷酸多态性位点-707C/T、-665T/C、-621C/T和-597A/G的基因型,计算相应的基因型频率及等位基因频率,进行χ2检验。结果-707C/T、-665T/C和-597A/G位点在中国山东汉族人群中未检测到单核苷酸多态性;-621C/T位点在中国山东汉族人群中存在单核苷酸多态性,且该位点CC/CT/TT基因型频率在非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝以及正常对照组中分别为0.238/0.500/0.262、0.269/0.448/0.284和0.280/0.394/0.326。但该位点的基因型频率和等位基因频率在三组之间均没有统计学差异。结论在中国山东汉族人群中,仅检测到TRAIL基因启动子区-621C/T位点的单核苷酸多态性,该多态性与脂肪肝的易感性没有统计学差异(P＞0.05)。     

Tim-4促进子宫颈癌细胞SiHa侵袭与迁移及其可能机制

目的： 探讨Tim-4促进子宫颈癌细胞侵袭与迁移及其相关机制。 方法： 用实时荧光定量PCR法检测子宫颈癌细胞系 Siha、Hela与子宫颈上皮永生化细胞系H8中Tim-4的表达水平。在较低表达Tim-4的Siha细胞系感染携Tim-4的慢病毒载体，荧 光显微镜观测Siha细胞系转染Tim-4的表达水平。用Transwell及划痕实验检测Tim-4对子宫颈癌细胞系Siha的侵袭与迁转移能 力的影响，用Western blotting检测Siha细胞转染Tim-4后MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin的变化。 结果： 子宫颈癌细胞系 Siha、Hela与宫颈上皮永生化细胞系H8相比高表达Tim-4。成功构建携Tim-4慢病毒载体的Siha细胞系；Tim-4明显抑制子宫颈 癌细胞系Siha的迁移与侵袭能力，且影响了MMP2、MMP9及N-cadherin、E-cadherin的表达水平。 结论： 过表达Tim-4可促进子 宫颈癌细胞的侵袭与迁移能力，其机制可能与Tim-4促进Siha细胞EMT转化有关。     

PKM2对黑色素瘤细胞侵袭与迁移及巨噬细胞M2转变的影响

目的 探讨黑色素瘤中丙酮酸激酶M2(PKM2)的表达情况及其与预后相关性,阐明PKM2如何通过糖酵解途径影响黑色素瘤侵袭与迁移及对巨噬细胞M2转变的影响。方法 利用TCGA数据库及免疫组化分析PKM2在黑色素瘤组织中的表达情况;利用基因过表达、敲低及ECAR技术分析PKM2对黑色素瘤细胞糖酵解过程影响;通过划痕实验及Transwell实验验证PKM2对黑色素瘤细胞侵袭与迁移的影响;通过细胞共培养检测PKM2对巨噬细胞M1/M2转变的影响。结果 TCGA数据库显示,与正常组织相比,PKM2 mRNA水平在黑色素瘤组织中表达明显升高(P<0.05),且PKM2高表达水平患者的生存率低于低/中表达患者(P=0.001 8);免疫组化染色结果显示,PKM2在黑色素瘤发生转移患者中的评分明显高于未转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。敲低PKM2表达后,黑色素瘤细胞糖酵解能力、糖酵解容量和乳酸水平均明显降低(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示,敲低PKM2表达后,黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力均明显降低,加入乳酸后,可部分逆转该现象。过表达组黑色素瘤巨噬细胞的肿瘤坏死因子...