用TMB法显示HRP逆行标记视网膜节细胞的实验技术

哺乳动物视网膜起源于中枢神经系统(CNS)，因此视神经轴索切断(简称轴切Axotomy)成为研究CNS损伤及再生的良好模型。研究发现：超过90％的视网膜节细胞(RGCs)在视神经轴切后1月内死亡，因此损伤后没有足够数量的RGC8存活是阻止再生的最大障碍。目前RGC8定量分析研究多采用荧光物质逆行标记，但荧光物质标记需用荧光显微镜观察，而且荧光衰退很快，不利于阳性结果的观察保存，因而限制了其推广应用。本文用HRP在视神经断端逆行标记RGCs，     

嗅成鞘细胞在新生大鼠嗅球的分布

中枢神经系统(CNS)内的胶质微环境是导致再生失败的重要因素。嗅觉神经元(olfactory sensory neurons,OSNs)具有终生再生的能力,因此嗅觉系统成为研究神经发生和轴突生长迁移的良好模型。嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是决定OSNs轴突能够终生再生的关键因素。周长满等对成年大鼠嗅成鞘细胞的分布进行了研究。     

慢性应激状态下大鼠睾酮水平测定

目的 通过对于慢性应激模型和运动疲劳模型大鼠的血清睾酮水平的对比研究,探讨慢性应激过程中睾酮水平变化规律及其与发生疲劳的关系.方法 建立大鼠慢性不可预测性应激模型及运动性疲劳模型;应用大鼠轨迹追踪系统对不同应激时间大鼠进行活动量观测,应用放射性免疫法对各组大鼠进行血清总睾酮和游离睾酮进行测定.结果 与正常组比较,慢性应激大鼠第1周组活动量(运动轨迹长度,下同)增加(P<0.01),第2周组活动量下降(P<0.01).各实验组大鼠游离睾酮与总睾酮之间均存在线性相关.慢性应激各组随应激时间延长,其游离睾酮与总睾酮比值呈逐渐下降趋势,并且能够达到运动疲劳组水平.结论 慢性应激条件可以明显引起大鼠睾酮水平下降.提示分层检测慢性疲劳综合征人群血清总睾酮及游离睾酮的水平以及进行动态性研究可能为本病症的诊断提供生化指标.以游离睾酮与总睾酮比值为指标检测雄性激素水平,能够更好地反映干预因素对动物生理上的影响.     

重组PCR快速基因定点突变的技术方法

聚合酶链式反应(PCR)是由Mullis等联合研制的一种在体外快速对特定DNA序列扩增的技术[1]。本研究通过重组PCR技术对growth associated protein-43(GAP-43)基因Ser41(丝氨酸)AGC定点突变为Ala41(甘氨酸)GCC,此方法比传统的体外基因突变技术更简单、快速而且经济。1材料和方法1.1     

钙调素在生长相关蛋白-43调控细胞周期中的作用

目的 探讨钙调素-43（CaM）在生长相关蛋白（-43）（GAP-43）调控细胞周期过程中的作用。方法 利用反转录病毒体系构建表达不同活性状态的GAP-43（即野生型、非磷酸化型和假磷酸化型GAP-43）NIH3T3细胞模型,并分别命名为表达野生型GAP-43（3T3-G）、 表达非磷酸化GAP-43（3T3-A）和表达假磷酸化GAP-43（3T3-D）;另设对照组（转染空载体NIH3T3细胞）。通过免疫组织化学及Western blotting鉴定各型细胞模型转入GAP-43的情况;应用免疫共沉淀检测各型GAP-43与CaM的功能关系;应用细胞生长曲线、BrdU累积标记法、BrdU脉冲标记法测定各型转GAP-43细胞的细胞周期。结果 免疫组织化学和Western blotting结果显示,NIH3T3细胞能够表达转入的各型GAP-43。其中,3T3-A 细胞增殖速度较其他细胞减缓。免疫共沉淀显示,3T3-A中有GAP-43 和CaM相互作用表现;3T3-G中GAP-43 和CaM有少量相互作用;3T3-D与3T3-P中则相互作用。累积BrdU测定,脉冲BrdU测定M期的实验表明,3T3-P细胞无明显周期改变;3T3-D与3T3-G细胞的周期延长;3T3-A细胞的周期明显延长并显示G1期明显延长。结论 表达GAP-43的细胞其增殖表现可能是由于GAP-43结合了CaM,使之与Ca²⁺的结合减少而引起细胞周期（尤其是G1期）的延长。     

rAAV2-EM>hGAD/EM>65重组载体的构建和功能检测

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10¹¹/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

正常和视神经损伤后Nogo(N-18)在金黄地鼠视网膜的表达

目的 观察Nogo-A蛋白在金黄地鼠视神经受损后不同时间点视网膜各层的表达，探讨Nogo-A蛋白的分布。方法 采用眶内眼球后2mm视神经切断术，动物分别存活3d、5d、7d后，取眼球固定、冰冻后做水平切片，分别进行Nogo(N—18)抗体的免疫组织化学染色，显微镜观察Nogo-A蛋白的表达。结果 在视网膜各层均有不同程度的Nogo-A蛋白表达；存活3d、5d、7d后在节细胞层表达强烈，其中3d的反应最明显；随着存活时间的延长，Nogo—A蛋白表达的节细胞层细胞数量逐渐下降。结论 Nogo-A蛋白并非神经胶质所特有的分泌物质；视网膜Nogo-A蛋白表达的分布范围和表达程度与视神经受损后的时间相关。     

嗅成鞘细胞移植促中枢神经再生的研究进展

中枢神经 (CNS)再生一直是神经科学中十分被关注的重大课题之一。早在上个世纪初 ,人们即已发现鱼类和两栖类动物 CNS损伤后有很强的再生能力而哺乳动物的 CNS却不能再生。经过多年研究发现造成 CNS再生失败的主要原因之一是损伤后 CNS内的微环境 (缺乏生长所需的神经营养因子、分泌产生抑制因子、胶质瘢痕形成等 )不利于轴突的再生 [1 ] 。将周围神经 (PNS)与 CNS加以比较 ,发现两者的区别主要在于形成髓鞘的胶质细胞不同。PNS的神经纤维的髓鞘由 Schwann细胞 (SCs)形成 ,而 CNS神经纤维的髓鞘则由少突胶质细胞形成。由此人们…     

新生大鼠嗅球纤维层组织移植促进受损视网膜节细胞存活和再生的研究

许多研究表明 ,改善局部微环境可促进受损中枢神经的再生。本研究对 SD大鼠进行眶内视神经切断术作为中枢神经损伤模型 ,将新生鼠嗅球纤维层组织植入视神经断端 ,动物术后分别存活 1、2、3、4周取眼球作水平冰冻切片 ,用 Nissl染色和生长相关蛋白 (GAP-4 3 )免疫组化方法观察视网膜节细胞的存活数量和蛋白的变化 ;并观察移植物中嗅成鞘细胞的存活状况。结果显示 :植入嗅组织后可见视网膜节细胞的存活数量和存活率明显增加 (P<0 .0 5 ) ;视网膜节细胞层 GAP-4 3持续表达 ;嗅成鞘细胞可以在视神经断端存活。本研究结果提示 ,移植嗅球纤维层有促进视网膜节细胞的存活和再生的作用。