骨骼肌细胞氧化应激损伤与黄芪多糖的干预研究

目的:建立氧化应激骨骼肌细胞模型,观察黄芪多糖(APS)对其的影响,为今后的实验提供依据。方法:过氧化氢(H_2O_2)分100μM、200μM、300μM、400μM 4组浓度干预骨骼肌细胞,每组6个复孔,分别培养12 h和24 h,MTT法检测增殖率;用100μM H_2O_2制作氧化应激骨骼肌细胞模型(模型组),给予0.2 mg/mL APS干预(干预组),并设正常组,每组6个复孔,培养24 h,MTT法检测增殖率,流式细胞仪检测凋亡率、活性氧簇(ROS)水平。结果:与正常组比较,100μM以上浓度的H_2O_2均有统计学意义(P0.01),随着H_2O_2浓度的增加,骨骼肌细胞的增殖率显著下降(P0.01)。与正常组比较,模型组的ROS水平及凋亡率均升高(P0.01);干预组的ROS水平及凋亡率均下降(P0.01),与模型组比较差异有统计学意义(P0.01)。结论:100μM H_2O_2是氧化应激骨骼肌细胞模型的有效浓度。APS具有良好的抗氧化性,具有改善肌肉减少症的作用。     

人三突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的：为了深人研究人低氧诱导因子1α（HIF-1α）基因对冠心病患者的血管新生作用，构建人三突变型HIF-1α真核表达载体（pShuttle2-HIF-1α-A1a4O2-Ala564-Ala803）。方法：双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-A1a564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803，胶回收前者酶切片段中300bp的小片段及后者6300bp的大片段，并将两者连接，重组成三突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，并进行酶切和PCR鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组三突变型穿梭质粒构建成功。结论：成功构建重组人三突变型HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，为进一步促进基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

血清平滑肌肌球蛋白重链水平动态变化在主动脉夹层诊治中的应用价值

目的观察主动脉夹层（AD）患者血清平滑肌肌球蛋白重链（smMHC）水平的动态变化情况,评价其在AD早期诊断和预后评价中的意义。方法选择AD患者42例（AD组）,于发病≤3h和发病后6,12,24h采肘静脉血利用酶联免疫吸附法测定血清smMHC水平,并与30例健康体检者（对照组）进行比较。结果AD组发病≤3h及发病后6,12h血清smMHC水平明显高于对照组[（88．6±21．7）,（59．4±18．7）,（41．3±10．7）ng／L比（17．2±8．3）ng／L],差异有统计学意义（P〈0．01）;AD组发病后24h血清smMHC水平[（18．9±9．5）ng／L]与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。StanfordA型患者（25例）发病3h内血清smMHC水平明显高于StanfordB型患者（17例）[（95．4±17．8）ng／L比（78．5±18．3）ng／L],差异有统计学意义（P〈0．01）;两者发病后6,12,24h血清smMHC比较差异无统计学意义（P〉0．05）。经股动脉插管腔内隔离术前血清smMHC水平明显高于术后[（58．6±15．9）ng／L比（30．1±12．5）ng／L],差异有统计学意义（P〈0．01）,术后血清smMHC水平迅速下降,术后12h与对照组比较差异无统计学意义[（18．7±8．9）ng／L比（17．2±813）ng／L,P〉0．05]。死亡患者（7例）发病≤3h及发病后6,12h血清smMHC水平明显高于存活患者（35例）[（101．2±20．7）ng／L比（86．1±18．9）．g／L、（65．2±16．7）ng／L比（58．2±14．2）ng／L、（50．4±10．8）ng／L比（39．5±8．3）ng／L],差异有统计学意义（P〈0．05）,死亡患者与存活患者发病后24h血清smMHC水平比较差异无统计学意义（P〉0．05）。发病≤3h检测血清smMHC水平的受试者工作特征曲线下面积（AUC）O．913,以51．7．g／L作为诊断临界值,敏感度和特异度分别为88．1％（37,42）和96．7％（29／30）;发病后6h检测的AUC0．865,以38．5ng／L作为诊断临?     

改良小切口手术方法配合中医药治疗股骨颈骨折126例疗效观察

目的:观察改良小切口手术方法配合中医药治疗股骨颈骨折的临床疗效。方法:将185例股骨颈骨折患者随机分为2组。治疗组126例,采用改良小切口手术方法,术后配合补益肝肾、强壮筋骨的壮筋养血汤(处方:当归、川芎、白芷、生地黄、牡丹皮、杜仲、三七、桃仁、续断、川牛膝、红花、乳香)加减治疗;对照组59例,单用改良小切口手术方法治疗。结果:总有效率治疗组为96.03%,对照组为81.36%,2组比较,差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:采用改良小切口的手术方法配合中医药治疗股骨颈骨折,疗效确切,并能显著改善患者术后的生活质量。     

重组腺病毒突变型人低氧诱导因子1α调节细胞周期的分子机制

背景:目前研究显示低氧诱导因子1α可诱导细胞周期停滞,但其机制尚不清楚.目的:研究重组腺病毒突变型人低氧诱导因子1α (Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803)调节细胞周期的分子机制.设计、时间及地点:对照实验,于2007-03/12在南方医科大学中医实验中心完成.材料:人结肠腺癌细胞株LoVo细胞由南方医院消化内科实验室提供;重组腺病毒Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803和对照病毒Ad-lacZ载体为自行构建.方法:将重组腺病毒Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803和对照病毒Ad-lacZ在HEK293A细胞中扩增,测定病毒滴度,然后在常氧下以感染复数10,20,30,40,50,60,70,80,90,100感染LoVo细胞.主要观察指标:X-gal染色检测重组腺病毒对LoVo细胞的感染效率;荧光定量PCR检测不同时间点低氧诱导因子1α与p21WAF1/CIP1的mRNA表达水平;MTT检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果:①重组腺病毒扩增后能获得较高的滴度,在LoVo细胞中具有很高的感染效率,感染效率与感染复数成量效关系,当感染复数为60时,感染效率为90%以上.②随低氧诱导因子1α表达的增高,p21WAF1/CIP1的表达也相应增高,两者存在正相关(r=0.945, P＜0.05).③与对照病毒相比,重组腺病毒感染后LoVo细胞增殖轻度受抑;细胞周期示G1期细胞明显增加,S期的细胞显著减少(P＜0.05).结论:①重组腺病毒载体介导的人HIF-1α-Ala564-Ala803基因可有效地转染LoVo细胞并成一定的量效关系.②低氧诱导因子1α在细胞周期的调节中发挥重要的作用,可能通过上调p21WAF1/CIP1的表达,诱导细胞周期停滞于G1期.     

HIF-1α基因转录活性位点在人骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞中的作用

目的研究HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因转录活性位点—Asn803位点在人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)分化成心肌细胞中的作用。方法重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1αnative、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402及Ad-HIF-1α564/803分别以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷(5-azacyti-dine,5-aza)诱导的hMSCs,于诱导培养后第6周:(1)提取细胞浆蛋白,应用酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I(cT-nI)含量,Western blot测定HIF-1α及VEGF蛋白表达水平;(2)更换含有120μmol/L姜黄素的心肌细胞诱导液培养1h,后用心肌细胞诱导液继续培养11h,接着用RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA表达水平的变化。结果经5-aza诱导hMSC s第6周后,与Ad-LacZ组、Ad-HIF-1αnative组、Ad-HIF-1α564组及Ad-HIF-1α564/402组相比,Ad-HIF-1α564/803组cTnI、VEGF表达水平最高,与前述其它各组相比差异有显著性(P值均<0.05)。经120μmol/L姜黄素抑制后VEGF mRNA表达水平较未抑制组平均减少了(50.9±4.6)%。然而,在CBP/p300活性受同等抑制条件下,Pro564Asn803双突变型HIF-1α基因组VEGF mRNA表达水平虽然较未抑制组减少了约40%,但仍显著高于Pro564单突变型HIF-1α基因组(P<0.05)。结论 HIF-1α基因转录活性位点(Asn803)在HIF-1α促进hMSCs向心肌细胞分化中起关键作用。     

腺病毒介导的HIF-1α基因对人骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的影响

目的研究腺病毒介导的野生型及突变型低氧诱导因子lot（hypoxia induciblef actor—1α,HIF—1α）基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）分化成心肌细胞（cardiomyocyte）中的作用。方法重组腺病毒Ad—LacZ、Ad—HIF—1αnative、Ad—HIF—1αAd—HIF—1α564/402及Ad—HIF—1α564/803分别以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导的hMSCs,于诱导培养后第6周提取细胞浆蛋白,应用酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量,Westernblot测定HIF-1α、VEGF及Nkx2．5蛋白表达水平。结果经5-aza诱导hMSCs第6周cTnI值为：对照组（0．700-＊-0．013）、Ad—LacZ组（0．702±0．006）、Ad—HIF-1αnative组（0．729±0．004）、Ad—HIF—1α564组（0．741±0．008）、Ad—HIF—1α564/402组（0．764±0．009）及Ad—HIF—1α564／803组（0．804±0．021）,各实验组cTnI表达差异有显著性（P〈0．05）,其中尤以Ad-HIF—1α564/803,组cTnI表达水平最高,与前述其它各组相比差异有显著性（P值均〈0．05）。Westemblot结果显示：与Ad—LacZ组相比,Ad—HIF—1αnative组、Ad—HIF—1α564组、Ad-HIF-1α564/402组、Ad-HIF-1α564,803组HIF-1α、VEGF及Nkx2．5蛋白均明显升高（P〈0．05）,其中以Ad—HIF-1α564/402组HIF—1α蛋白表达水平最高（P值均〈0．05）,以Ad—HIF—1α564／803组VEGF及Nkx2．5蛋白表达水平最高（P〈0．05）。结论野生型及突变型HIF-1α基因均可促进hMSCs向心肌细胞分化,且HIF—1α564/803突变型作用最强。