成纤维细胞生长因子抑制长链非编码RNA Malat1的表达及对软骨细胞增殖的影响

目的 探讨在软骨细胞模型中成纤维细胞生长因子通路对长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA) Malat1的调控作用.方法 采用Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 1,Fgfr1)组织特异性敲除小鼠和Ⅲ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 3,Fgfr3)敲除小鼠的原代软骨,以及利用软骨细胞系培养充当软骨细胞模型,成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)及下游细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路阻断剂U0126处理细胞,利用荧光定量PCR检测Malat1的表达变化.在ATDC5细胞模型中通过siRNA转染干扰Malat1或Fgfr1,质粒转染过表达Fgfr1,利用荧光定量PCR检测Malat1的表达,细胞计数检测细胞增殖变化.结果Malat1被干扰24、36、48、60 h后,ATDC5细胞增殖速度显著减慢(P＜0.05),FGF2处理ATDC5细胞24 h后Malat1表达显著下降(P＜0.05),且ERK通路抑制剂U0126处理细胞后FGF2对Malat1的抑制作用消失.Fgfr1条件性敲除或si-Fgfr1干扰后Malat1表达显著升高(P＜0.05),且FGF2对Malat1的抑制作用消失,Fgfr1在ATDC5细胞中过表达后Malat1表达与对照组相比显著降低(P＜0.05).结论软骨细胞中FGF2可能通过Fgfr1激活下游ERK通路,抑制了Malat1的表达,从而影响软骨细胞增殖.     

内毒素血症小鼠骨骼Toll样受体4基因的变化

目的 通过检测内毒素血症模型动物骨骼相关基因表达变化,进一步明确内毒素对机体的损害机制,为下一步研究骨骼变化对脏器产生何种影响奠定基础.方法 腹腔注射内毒素脂多糖(LPS)制作内毒素血症小鼠模型.将48只小鼠随机分为正常组和LPS处理4、6、8、12、24、48和72 h组,每组6只.采尾血计数全血白细胞;取眼眶血检测肝、肾功能;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨骼中TLR4 mRNA表达;苏木素-伊红(HE)染色,镜下观察骨骼病理学变化.结果 与正常组比较,LPS 4 h组白细胞计数显著下降(P＜0.01),之后逐渐升高,于72 h时显著高于正常组(P＜0.05);LPS 4 h和6 h组丙氨酸转氨酶(ALT)水平显著升高(P均＜0.05),于8 h降至正常水平(P＞0.05);LPS 6 h组血尿素氮(BUN)水平逐渐升高(P＜0.05),于8 h达峰值(P＜0.05),然后下降,12 h趋于正常(P＞0.05);LPS 6 h组TLR4 mRNA表达增加(P＜0.01),24 h达峰值(P＜0.01),然后逐渐下降,72 h仍处在较高水平(P＜0.05).LPS作用于骨骼后,HE染色显示骨骼无明显改变.结论 内毒素血症中骨骼TLR4 mRNA表达量显著增加.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑靶向下调FGFR2缓解Apert综合征小鼠颅缝早闭

Apert综合征 (Apert Syndrome, AS) 是一类常染色体显性遗传疾病,主要表现为颅缝早闭、中面部发育不良、 并指 (趾)、智力发育障碍等,多由FGFR2分子功能增强型点突变引起。目前,此疾病主要靠手术矫形来恢复功能,其中大脑等病变部位手术难度大,难以实施,且通常需要多次手术。CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类遗传病治疗中具有巨大潜力。本研究筛选到靶向FGFR2基因的gRNA,与Cas9经慢病毒包装后作用于Apert小鼠 (FGFR2^+/P253R) 的原代颅骨细胞、体外培养的颅骨以及活体小鼠颅骨中,可敲低FGFR2的表达,改善Apert原代颅骨细胞的分化程度。CRISPR/Cas9处理体外培养的颅骨及注射至 Apert 小鼠头颅,颅骨冠状缝早闭状态有效缓解,异常降低的颅骨骨量、骨密度等也显著改善,表明 CRISPR/Cas9基因编辑可缓解 Apert小鼠头颅异常。本研究为 Apert综合征的基因治疗提供了实验依据,有望为其它骨骼遗传病治疗提供新的策略与借鉴。     

原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景：传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降。如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键。 目的：课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。 材料：C57BL/6品系新生小鼠9只。 方法：采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6 新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定。当细胞90%融合时以含5.5 mg/L人转铁蛋白,3×10-8 mol/L亚硒酸钠,10 mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导。 主要观察指标：诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X 型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定。 结果：原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4~6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d 明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结。与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多。 结论：采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程。     

Ⅱ型常染色体显性遗传骨硬化症一个家系的临床和遗传学分析

目的检测常染色体显性遗传性骨硬化症一个家系氯离子通道7（chloride channel 7,CLCN7）基因的突变情况。方法收集-骨硬化症家系中2例患者及先证者父母共4人的血液标本,提取基因组DNA,用PCR扩增CLCN7外显子并对所有外显子进行测序分析。结果2例患者及先证者父亲均存在CLCN7第10号外显子856位核苷酸C变成T,导致286位的精氨酸（Arg）被色氨酸（Trp）代替（R286W）,为一已知突变;先证者母亲无此突变。存在CLCN7突变的3人临床表现不同,提示该遗传疾病存在外显不全。结论CLC7R286W突变是导致该家系骨硬化症的致病原因。