心肌肌钙蛋白T标志物诊断急性心肌梗死的应用研究

目的探讨心肌肌钙蛋白T(CTT)对诊断急性心肌梗死(AMI)的临床检测价值。方法采用ELISA法和IFCC法测定病例组及对照组血清CTT水平和肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)水平,并进行统计学分析。结果AMI组中血清CTT水平为(4.790±2.384)ng/mL,阳性率为97.6%,和非AMI心肌损伤组和对照组比较差异有统计学意义(P均<0.01);CK-MB水平为(225.7±48.6)IU/L,显著高于非AMI心肌损伤组和对照组(P<0.01,P<0.01);而CK-MB的阳性率为94.0%,显著高于对照组(P<0.01),但与非AMI心肌损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在非AMI心肌损伤组中2例不稳定型心绞痛和1例急性心力衰竭患者呈CTT弱阳性,阳性率为4.3%。结论CTT作为标志物诊断AMI有较高的特异性和敏感性,可广泛应用。     

转染异种CXCR4基因下调黑色素瘤的致瘤性

[目的]利用基因转染技术将人源趋化因子受体CXCR4基因转染小鼠黑色素瘤细胞B16,研究异源CXCR4基因转染对肿瘤致瘤性的影响.[方法]脂质体转染法将人CXCR4基因导入小鼠黑色素瘤B16细胞中,RT-PCR、流式细胞术(FACS)分析人CXCR4在B16细胞中的表达,体内成瘸实验验证B16细胞的致瘤性.[结果]人CXCR4基因转染B16细胞,G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR检测到人CXCR4 mRNA的表达,流式细胞分析检测到人CXCR4蛋白的表达,体内成瘤实验证实异源CXCR4转染降低了B16的生长速度.[结论]异源CXCR4基因转染下调黑色素瘤的致瘤性,其机制可能与异源CXCR4诱导的免疫交叉反应有关.     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞cDNA消减文库

目的利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞的消减文库,为进一步从基因表达水平研究空间特殊环境影响肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定基础。方法采用SuperSMART和SSH技术,以太空诱变的宫颈癌48A9细胞株作为Tester,地面正常对照组宫颈癌细胞株作为Driver,分离太空诱变的宫颈癌48A9细胞中差异表达的基因片段;连接T载体,转化宿主菌,构建太空诱变的宫颈癌48A9细胞cDNA抑制性消减文库。结果经蓝白筛选后随机挑取300个阳性克隆,以接头1和2R内侧序列为引物进行菌液PCR扩增鉴定阳性克隆,结果显示其中288个克隆有插入片段,阳性率为96％,大小分布在0．2—1．0kb间。结论本实验利用抑制性消减杂交技术成功的构建了高质量的太空诱变宫颈癌细胞消减文库,为进一步从基因水平阐明太空特殊环境对肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定了基础。     

EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用

目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关。本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平。结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EG-FL7。并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质。结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究。     

抗人心肌肌钙蛋白T杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

[目的]建立稳定分泌抗人心肌肌钙蛋白T(cardic troponin,cTnT)单克隆抗体的杂交瘤细胞株.[方法]以纯化的cTnT(分子质量为3.7×107)加福氏佐剂免疫8周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合,以酶联免疫吸附法(ELISA)筛选.阳性克隆以有限稀释法进行克隆化、Western blot法鉴定所制备的单克隆抗体.[结果]共筛出4株稳定分泌抗cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的抗体效价高达10-5,经免疫学鉴定其分泌的免疫球蛋白类型均为IgG1、κ型,且Western b1ot鉴定4株细胞株所分泌的抗体均与人cTnT均有很好的反应性.[结论]获得4株稳定分泌抗人cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为cTnT的临床研究提供了可能性.     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

γ-氨基丁酸对肝癌细胞株HepG-2恶性表型的影响

目的：研究γ-氨基丁酸（GABA）对肝癌细胞株HepG-2增殖能力及恶性表型的影响。方法：用不同浓度的GABA与人肝癌细胞HepG-2作用后,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长速度,并测定其倍增时间,流式细胞仪检测细胞周期的改变,软琼脂细胞集落形式实验和裸鼠成瘤实验检测细胞的恶性表型。结果：MTT实验结果表明实验组细胞的生长速度明显快于对照组细胞的生长速度,且呈剂量依赖性,其细胞周期分布也发生改变,G1期细胞减少,S期细胞增多;对照组细胞和各浓度组细胞的平均倍增时间分别为39.0,30.6,30.0,27.3,26.6和38.2 h,软琼脂细胞集落形成率依次为3.2%,4.2%,5.4%,6.6%,6.5%,3.5%,Balb/c裸鼠成瘤实验显示,对照组和实验组的肿瘤平均质量依次为0.285和1.382 g,其差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：GABA能促进细胞增殖,并引起细胞恶化改变。     

全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的从全人源抗鼻咽癌噬菌体抗体库中筛选特异性单链抗体（ScFv）,并对其特异性进行鉴定。方法通过噬菌体表面展示技术把ScFv表达在噬菌体表面,以鼻咽癌细胞作为抗原,用抗原递减法,通过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体,及ELISA筛选,获得特异阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果通过对抗体库进行三轮正负淘洗和富集后,随机挑选4212个克隆进行ELISA,发现3个克隆对CNE2呈强阳性反应,而与人正常细胞系HUVEC等呈弱阳性反应或不反应。对克隆HNSA033进一步进行免疫细胞化学验证,结果与ELISA反应一致;免疫组织化学鉴定表明克隆HNSA033与鼻咽癌组织和鼻咽组织阳性率的差别有统计学意义。结论通过淘选富集、ELISA和免疫化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆,为鼻咽癌发病机制的研究和临床诊断以及治疗奠定了基础。     

MicroRNA-33a 靶向 Twist1 调节宫颈癌细胞的侵袭

目的：研究转录因子Twist1在宫颈癌组织中的表达及其在宫颈癌细胞进展过程中的作用。方法：免疫组织 化学检测32对临床宫颈癌组织及正常宫颈组织中Twist1的表达情况,并运用RNA干扰技术沉默宫颈癌HeLa细胞内Twist1 后检测细胞的侵袭能力以及侵袭相关基因表达的变化;采用Pearson相关性检验分析Twist1与microRNA-33a(miR-33a)在宫 颈癌组织内的关系,并分析miR-33a对Twist1的调节关系及其对细胞侵袭能力的影响。结果：Twist1在宫颈癌组织和正 常宫颈组织中表达的阳性率分别为75.0%(24/32)和21.9%(7/32),二者表达差异具有统计学意义(P<0.05);Twist1 shRNA 能显著减低HeLa细胞的体外侵袭能力。宫颈癌组织中miR-33a的表达较正常组织减低(P<0.05),并与Twist1呈负相关 (r=−0.661,P<0.05);而宫颈癌细胞内过表达miR-33a可减低Tiwst1的表达(P<0.05),并减弱细胞的体外侵袭能力。结论： Twist1在宫颈癌的侵袭转移过程中发挥着重要的作用,miR-33a为上游调控Twist1的表达及细胞侵袭能力的抑癌基因。