人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564。方法 采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF-1α—Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应（PCR）定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α—Ala402-Ala564。结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564构建成功。结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。     

人三突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的：为了深人研究人低氧诱导因子1α（HIF-1α）基因对冠心病患者的血管新生作用，构建人三突变型HIF-1α真核表达载体（pShuttle2-HIF-1α-A1a4O2-Ala564-Ala803）。方法：双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-A1a564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803，胶回收前者酶切片段中300bp的小片段及后者6300bp的大片段，并将两者连接，重组成三突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，并进行酶切和PCR鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组三突变型穿梭质粒构建成功。结论：成功构建重组人三突变型HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，为进一步促进基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

腺病毒介导突变体HIF-1α基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察突变体HIF-1α基因在体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内的表达以及对其增殖的影响.方法 以LacZ为对照,用野生型HIF-1α、单突变体HIF-1α564和双突变体HIF-1α564 803转染体外培养的大鼠VSMCs,Western blot测定HIF-1α蛋白表达:MTS/PES法确定大鼠VSMCs的增殖状态.结果 Western blot结果显示以LacZ组的密度扫描结果为1,HIF-1α564(3.284±0.582),HIF-1α564 803(4.026±0.445)与野生型HIF-1α(2.429±0.765)相比差异有显著性(P＜0.05),HIF-1α564与HIF-1α564 803组之间差异无显著性(P＞0.05).MTS/PMS比色结果显示:转染的第1天HIF-1α(0.242±0.020),HIF-1α564(0.234±0.021),HIF-1α564 803(0.223±0.020)3组均可抑制VSMCs增殖,与对照LacZ组(0.256±0.020)相比差异有显著性(P＜0.05),但是各组间差异无显著性(P＞0.05).转染第3,5,7天HIF-1α564,HIF-1α564 803组较HIF-1α组相比,差异有显著性(P＜0.05),尤以HIF-1α564 803组抑制大鼠VSMCs增殖能力最显著(P＜0.05).第7天HIF-1α564 803组Hoechst 33258与TUNEL双重荧光染色提示大鼠VSMCs发生了凋亡.结论 腺病毒介导的突变体HIF-1α基因能抑制大鼠VSMCs的增殖,突变体较野生型HIF-1α抑制作用更强,且双突变体HIF-1α564 803能诱导大鼠VSMCs发生凋亡.     

重组腺病毒突变型人低氧诱导因子1α对细胞凋亡调节机制的研究

目的 研究重组腺病毒突变型人低氧诱导因子1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803)对细胞凋亡的调节机制.方法 将重组腺病毒Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803和对照病毒Ad-lacZ感染常氧下LoVo细胞.荧光定量PCR检测不同时间点HIF-1α,p21WAF1/CIP1的mRNA表达水平,Westernblot检测HIF-1α,p21WAF1/CIP1的蛋白表达水平,及Hoechst染色检测loVo细胞的凋亡率.结果 Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803感染LoVo细胞后随着HIF-1αmRNA和蛋白表达水平的增高.p21WAF1/CIP1的mRNA和蛋白表达水平也相应增高,Hoechst染色示Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803组细胞的凋亡率(16.2%)gq显高于对照组(5.5%)(P=0.00).结论 HIF-1α可通过上调p21WAF1/CIP1的表达,诱导细胞周期停滞,促进细胞凋亡.     

人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人双突变型HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒表达载体,研究人双突变型低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用.方法 在业已完成的pShuttle2-HIF-1α-Ala564的基础上,用PCR定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-lα-Ala402-Ala564,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒连接,重组成pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为重组Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒.结果 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564(双突变型),为冠心病的突变型HIF-1α基因治疗研究奠定基础.     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor 1 alpha,HIF-1α)腺病毒表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础.方法 采用分子克隆技术,以Kpn Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切pcDNA3.1( )-HIF1α质粒获得HIF-1α cDNA,克隆到质粒pEGFP-C1,以Nhe Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切得到EGFP-HIF-1α cDNA,重组到穿梭质粒pShuttle2,再以PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切重组穿梭质粒,获得含有EGFP-HIF-1α cDNA的表达盒,与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-EGFP-HIF-1α腺病毒质粒,脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察结果,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-EGFP-HIF-1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定.结果 经酶切鉴定及PCR证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109nfu/ml.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α,为冠心病的HIF-1α基因治疗研究奠定更直观的基础.     

构建双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的实验

目的:前期实验已成功构建无突变及564位是单突变腺病毒载体。在此基础上构建人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体,为进一步研究低氧诱导因子1α基因及其突变体的临床应用奠定基础。方法:实验于2005-12/2006-12在南方医院心内科重点实验室完成。①实验材料:限制性内切酶PacI(NEB),PI-SceI、I-CeuI(Clontech);IPTG、X-Gal(Takara),转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen),凝胶回收试剂盒(Omega);DMEM(Omega);小牛血清(PAA);北京天为时代公司病毒基因组提取试剂盒;HIF-1α单克隆抗体(Chemicon International公司);羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗(北京鼎国生物公司)。质粒、菌珠、细胞系等:Adeno-XTM-Adenoviral Expression Systems(BD.CLONTECH):包括有pShuttle2、pShuttle2-lacZ、Adeno-XTMViralDNA等;重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803及pShuttle2-lacZ(本室已构建成功);大肠杆菌DH5α(本室保存);HEK293A细胞(中科院上海细胞所)。②实验方法:采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,然后切下含有低氧诱导因子1αcDNA表达的盒片段,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-HIF-1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293A细胞中包装成为重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803。③实验评估:进行PCR鉴定及滴度测定。用重组腺病毒转染293A,采用Westernblot鉴定低氧诱导因子1α蛋白表达。结果:提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala564-Ala803以引物A、B和引物1、2、3、4进行PCR鉴定,分别扩增出287,460,214bp的3种引物片段,与预期一致,经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功。pAdeno-lacZ转染293A细胞后X-Gal原位染色,显示约有近20%左右细胞染成蓝色,病毒滴度为6.8×107pfu/mL。Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803转染293A后稳定表达低氧诱导因子1α蛋白。结论:成功构建了重组腺病毒突变型的Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803。     

缺氧诱导因子1与冠心病发病机制和治疗研究进展

缺氧诱导因子1(HIF-1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种转录因子，参与对低氧反应基因的调控，从而使机体对低氧刺激产生复杂的病理生理反应。近年来研究表明，HIF1会引起血管新生、血管平滑肌舒缩、抑制血小板凝聚、红细胞增生和冠状动脉粥样硬化进展。但HIF-1在冠心病发病中的作用机制及其对治疗效果的影响尚有争议。     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

人3突变型低氧诱导因子1 α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的为了深入研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用,构建人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。方法双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,凝胶回收前者酶切片段中大小为300bp的小片段及后者酶切片段中大小为6300bp的大片段,并将两者连接,重组成3突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803,并进行酶切和PCR鉴定。鉴定正确后,采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组3突变型穿梭载体,获得含有3突变型HIF-1α(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架载体Adeno-XTM Viral DNA连接,重组成3突变型腺病毒载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),再进行酶切及测序鉴定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组3突变型真核表达载体和腺病毒表达载体质粒构建成功。结论成功构建重组人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)和人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。