携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒,探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列,将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒,经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒,利用RT-PCR及Western blot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2,采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）,骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及BMP下游靶基因Id 1、Runx 2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒,并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒,转染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达,成骨相关基因Runx 2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2,该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程,从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。     

无标签NT-proBNP重组蛋白的获得及多克隆抗体的制备

摘要：目的：通过原核表达,获得不带标签的NT-proBNP重组蛋白,并用其免疫新西兰大白兔,制备兔抗NT-proBNP抗体。 方法：从重组菌pET-32a(+)-NT-proBNP提取重组质粒,通过PCR扩增出目的DNA片段,插入pCold TF载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白。经镍柱亲和纯化、HRV 3C蛋白酶酶切、镍柱亲和纯化,制备不带标签的纯蛋白质,并用临床商品化试剂盒验证其抗原性。用该蛋白质免疫新西兰大白兔制备抗体,western blot鉴定其特异性。 结果：成功获得高纯度的不带标签的NT-proBNP蛋白,该蛋白质能被商品化的试剂盒识别。用该蛋白质免疫新西兰大白兔成功制备出高效价高特异的抗体。 结论：成功制备高纯度的无标签NT-proBNP蛋白及其多克隆抗体,为NT-proBNP在临床上的广泛应用奠定了基础。