一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

新型二聚体蝎型探针技术在结核分枝杆菌荧光定量聚合酶链反应中的应用

目的利用二聚体蝎型荧光探针技术，建立一种敏感特异、快速价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌DNA荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法。方法构建重组质粒pMD18-T-senX3-regX3 IR作为标准品，自行设计二聚体蝎型探针，优化定量PCR体系，并进行方法学评价及初步临床应用。结果（1）成功构建了重组质粒pMD18-T-senX3-regX3IR。（2）建立了利用二聚体蝎型荧光探针的荧光定量PCR方法，其线性范围：10^1～10^7拷贝／μ1；灵敏度：10^1拷贝／μ1；重复性：批内变异系数（CV）为2．35％，批间CV为3．17％，日间CV为4．06％；特异性100％；（3）初步临床应用证明：该方法比商品化Taqman方法阳性检出率更高，检测时间更短和成本也明显降低。结论本研究首次建立了以二聚体蝎型荧光探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法，这为应用二聚体蝎型荧光探针技术开辟检测结核分枝杆菌的分子诊断新途径奠定了一定的基础。     

自身猝灭探针定量PCR检测HCV方法的建立

目的 建立自身猝灭荧光探针定量PCR技术检测HCV方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV5'NCR作为标准品,并通过Sigma在线软件设计自身猝灭探针,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.结果 建立了自身猝灭荧光探针的定量PCR方法,线性为101～1010copies/μl;灵敏度达50 copies/μl;批内CV为6.1%,批间CV为6.5%,日间CV为6.8%;特异性为100%,与其他肝炎病毒无交叉反应.与紫外定量方法比较,结果差异无显著性,且高度相关.结论 以自身猝灭荧光探针建立的HCV荧光定量PCR检测方法,灵敏度高、特异性强,为新型试剂盒的开发奠定了基础.     

基因芯片在感染性疾病研究中的应用

人类基因组计划、病原体基因组测序的完成,以及基因芯片技术的出现,为研究感染性疾病的致病分子开拓了新的天地。基因芯片技术因具有检测快速、高效、并行等特点,加速了对微生物和宿主之间复杂的遗传学过程的认识,有利于发现病原体毒力相关基因和宿主防御策略,从而有助于感染性疾病的诊断、治疗和预防。     

PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果:DNA序列与GenBank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.     

肺炎链球菌comX基因可影响细菌毒力基因表达

目的:探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系.方法:采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株,通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用RT-PCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶(phd),分泌型IgA结合蛋白(sIgA),肺炎链球菌自溶酶(lytA),肺炎链球菌神经氨酸酶A (nanA)和肺炎链球菌溶血素(ply)在细菌感受态发生过程中的表达,并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果:野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子(CSP)诱导表达增加;虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论:comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.     

孕妇生殖道B群链球菌快速检测方法的建立和初步应用

目的建立一种快速、灵敏、特异的PCR检测孕妇生殖道GBS感染的方法。方法根据GBS保守序列:cfb设计特异性扩增引物,优化PCR反应,通过电泳判断结果,同时使用UNG酶,dUTP避免PCR产物污染。结果本研究通过PCR条件的反复摸索,优化了PCR检测方法。同微生物培养方法相比,PCR方法灵敏度更高,检测更快速。直接煮沸法和试剂盒法的DNA提取效率具有差别,试剂盒法更适合临床诊断使用。结论本研究成功建立了快速、灵敏、特异的孕妇生殖道GBSPCR检测方法。     

基因芯片在感染性疾病研究中的应用

人类基因组计划、病原体基因组测序的完成，以及基因芯片技术的出现，为研究感染性疾病的致病分子开拓了新的天地。基因芯片技术因具有检测快速、高效、并行等特点，加速了对微生物和宿主之间复杂的遗传学过程的认识，有利于发现病原体毒力相关基因和宿主防御策略，从而有助于感染性疾病的诊断、治疗和预防。     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.     

HtrA基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究

目的:HtrA基因可编码肺炎链球菌的一种重要蛋白酶,本文目的是探索HtrA基因缺陷对细菌毒力的影响. 方法:用插入复制失活的方式使HtrA基因缺失,通过RT-PCR分析毒力因子表达,并通过动物试验观察HtrA基因缺陷株毒力改变情况. 结果:RT-PCR显示HtrA缺陷株毒力因子表达低于野毒株,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降;小鼠毒力试验表明野毒株半数致死时间22 h,而缺陷株半数致死时间8 d,P＜0.01,有显著性差异;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野毒株. 结论:HtrA基因缺陷使肺炎链球菌多种毒力因子表达减弱,自然转化能力下降,毒力降低.