肝细胞损伤条件培养基对大鼠骨髓间充质干细胞肝向分化的促进作用

目的：制备肝细胞损伤条件培养基（CM）,体外模拟损伤组织微环境,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）肝向分化的作用。方法：取1周龄乳鼠,经差时贴壁和差速梯度法结合优化梯度离心和贴壁换液时间分离培养BMMSCs。取6~8周龄大鼠,腹腔注射60%四氯化碳溶液（0.75 mL·kg^-1）制备肝细胞损伤组织匀浆上清（CM1）和肝细胞损伤血清（CM2）。将第3代（P3）BMMSCs随机分为0% CM组（对照组,采用10% FBS L-DMEM培养）、10% CM1组、20% CM2组和10% CM1+10% CM2组。倒置显微镜下观察细胞形态表现,免疫组织化学法检测各组BMMSCs表面标志物CD105和各组细胞中白蛋白（ALB）的阳性表达率,油红O染色法检测BMMSCs成脂分化的脂滴形成阳性率;RT-PCR法检测各组细胞中甲胎蛋白（AFP）和ALB的表达水平,糖原染色法检测细胞中糖原合成阳性率,鉴定并比较各组BMMSCs肝向分化能力。结果：骨髓细胞原代培养72 h,贴壁细胞呈圆形或梭形,铺满瓶底时呈均匀有序的成纤维梭形状,P3 BMMSCs表面标志物CD105呈阳性表达。P3 BMMSCs经地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和消炎痛（DX+IBMX+IS+ID）联合诱导后4 d,镜下可见脂滴形成。P3 BMMSCs经CM诱导后细胞中AFP和ALB呈阳性表达,细胞糖原染色呈阳性。诱导后7 d,含CM成分的3组BMMSCs中均可见细胞胞浆内容物变得丰富,细胞呈圆形、三角形或肝板样排列;诱导后7、14和21 d,与对照组比较,含CM成分的3组BMMSCs中ALB阳性表达率均明显增加（P<0.01）;10% CM1+10% CM2组BMMSCs中ALB阳性表达率高于10% CM1组和20% CM2组（P<0.05）。诱导后7和14 d,与对照组比较,含CM成分的3组BMMSCs中糖原合成阳性率均明显增加（P<0.01）;10% CM1+10% CM2组BMMSCs中糖原合成阳性率高于10% CM1组和20% CM2组（P<0.05）。结论：CM1和CM2可诱导大鼠BMMSCs向肝细胞分化,在达到相同诱导作用效果时所需的CM1和CM2浓度更低;CM1和CM2提供的微环境更有利于BMMSCs向肝细胞分化,其诱导细胞分化效率更高。