miR-146a在HepG2.2.15细胞中对c-Myc基因表达影响的研究

目的 构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-146a,探究其在HepG2.2.15肝癌细胞中对c-Myc基因的表达调控作用.方法 PCR扩增has-miR-146a的前体基因片段(pre-has-miR-146a),双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过菌落PCR、双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到HepG2.2.15肝癌细胞中作为实验组,同时设空载体组(转染pmR-mCherry空质粒组),空白组(转染试剂Lipofectamin0 2000+ PBS),24、48 h后观察载体荧光蛋白表达量,qPCR检测各组细胞has-miR-146a表达情况;转染24、48 h后qPCR检测c-Myc基因mRNA表达量,48 h后Western blot检测c-Myc蛋白表达水平.结果 经菌落PCR、双酶切和测序证实,pre-has-miR-146a基因片段插入pmR-mCherry载体中;实验组和空载体组转染24、48 h荧光显微镜观察可见强荧光,与非荧光条件下作对比,转染效率在50％～60％;实验组has-miR-146a表达量明显高于空载体组和空白组(P＜0.01);转染24、48 h后实验组细胞c-Myc基因mRNA表达量较空载体组和空白组低(P＜0.05);转染48 h后,蛋白表达量较空载体组和空白组低(P＜0.01).结论成功构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-has-146a,该重组载体可稳定表达has-miR-146a;has-miR-146a可以下调c-Myc癌基因的表达,可以作为治疗原发性肝癌的潜在靶点之一.     

人microRNA-21真核过表达载体的构建及其在 HepG2．2．15细胞中上调c-myc基因的表达

目的：构建人微小RNA‐21（microRNA‐21,miRNA‐21）真核过表达载体pmR‐21,探讨其在 HepG2．2．15细胞中对c‐myc基因表达的调控作用。方法 PCR扩增miRNA‐21的前体基因片段（pre‐miRNA‐21）,双酶切后连接到pmR‐mCherry载体上,通过双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到 HepG2．2．15细胞中为实验组,另设空载体组（转染 pmR‐mCherry空质粒组）,空白组（未转染组）,阳性对照组（HepG2细胞）,24 h后观察载体荧光蛋白表达情况,流式细胞术检测转染效率,实时荧光定量PCR评估miRNA‐21的表达情况;转染72 h后,RT‐PCR和Western blot检测c‐myc mRNA及蛋白表达水平;CCK‐8法检测各组细胞增殖情况。结果经双酶切和测序验证,目的基因片段插入载体中;实验组及空载体组转染24 h后细胞内可见强荧光,转染效率大于50％;实验组细胞 miRNA‐21表达较空载体组、空白组水平升高;转染72 h后实验组细胞c‐myc mRNA表达较空载体组、空白组升高;实验组细胞增殖快于空载体组及空白组,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论成功构建miRNA‐21真核过表达载体 pmR‐21,该重组载体可稳定表达 miRNA‐21;miRNA‐21可上调 c‐myc基因的表达,c‐myc基因是miRNA‐21发挥促癌作用的靶点之一。     

高通量测序技术在儿童脓毒症病原学诊断中的效能评价

目的:探讨高通量测序技术(mNGS)在儿童脓毒症病原学的诊断效能。方法:前瞻性纳入2019年3月至2020年12月江门市妇幼保健院PICU收治的脓毒症患儿,采集其血液标本进行血培养及mNGS同步检测。以儿童序贯器官功能障碍评分(pSOFA)作为儿童脓毒症临床诊断标准,应用Kappa评价方法对临床诊断标准、血培养结果、mNGS结果进行诊断一致性分析。以临床诊断标准为“金标准”,计算血培养与mNGS的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度及Youden指数,以评估比较两者的诊断效能。结果:行血培养及mNGS同步检测的62例脓毒症患儿中,中位年龄为17个月,婴幼儿占85.5%;pSOFA评分≥2分共40例,占64.5%,感染灶以呼吸系统为主。血培养与mNGS具有诊断一致性,同时差异具有统计学意义(P<0.05)。临床诊断标准与血培养、mNGS结果的Kappa值均为0.745,具有诊断一致性。在40例符合临床诊断标准的患儿中,其中18例血培养及mNGS结果均为阳性且病原体一致,17例血培养阴性而mNGS结果阳性。血培养与mNGS的敏感度分别为45%、87.5%,特异度为68.1%...