miR-29b过表达对NIH/3T3细胞直接靶向作用及细胞功能的影响

目的:研究miR-29b过表达对NIH/3T3细胞直接靶向作用及其细胞功能变化的影响。方法:将活化的NIH/3T3细胞,分为空白对照(Control)组、miR-29b mimics组、miR-Negative Control(miR-NC)组、TGF-β1组、TGF-β1+miR-29b mimics组、TGF-β1+miR-NC组。采用免疫荧光技术、RT-PCR及Western Blot检测miR-29b、COL1α1、COL3α1、TIMP-1、MMP-9、HSP47、α-SMA表达,流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞增殖。结果:miR-29bmimics组与miR-NC组和Control组比较,miR-29b表达上调,COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白表达下调(P0.05)。TGF-β1+miR-29b mimics组与TGF-β1组、TGF-β1+miR-NC组比较,miR-29b表达明显上调(P0.01),COL1α1、COL3α1、TIMP-1、HSP47、α-SMA mRNA及蛋白均明显下降,MMP-9 mRNA及蛋白均明显升高(P0.05)。TGF-β1+miR-29b mimics组与TGF-β1组、TGF-β1+miR-NC组比较早期凋亡明显增多,而细胞活力明显下降,与Control组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:COL1α1及COL3α1是miR-29b的直接靶向调控分子,体外上调miR-29b表达可抑制TGF-β1致纤维化相关因子表达及细胞活力,并可促进细胞凋亡,为进一步研究体内肝纤维化奠定了基础。     

热休克蛋白47在日本血吸虫病肝纤维化病程的动态变化

目的观察热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)在日本血吸虫病患者肝脏组织中的表达情况及其在日本血吸虫病肝纤维化小鼠动物模型中的动态变化。方法收集2008—2012年期间同济医院门诊和住院部日本血吸虫病肝纤维化患者肝穿标本72例。用免疫组织化学法检测HSP47表达;Masson染色观察胶原增生情况;实时荧光定量PCR检测HSP47、Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及转移生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)m RNA水平的表达。构建实验性日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型,分别于感染后第6、8、12周取小鼠肝组织,用免疫组织化学法检测HSP47表达,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测HSP47的m RNA和蛋白水平表达及Ⅰ型胶原纤维增生情况。结果日本血吸虫病肝纤维化患者肝组织中的HSP47主要表达在肝脏间质细胞及虫卵结节周围,并随纤维化程度进展显著增多(P均0.01),与Ⅰ型胶原增生趋势平行。各纤维化分期患者肝组织胶原及纤维化相关因子CTGF及TGF-β1 m RNA表达均明显高于S0期无纤维化患者(P均0.01)。在肝纤维化模型小鼠中HSP47随纤维化进展其表达亦显著升高,感染后第6、8、12周,HSP47及Ⅰ型胶原的表达量均显著高于正常对照小鼠(P均0.01),同血吸虫病肝纤维化患者的表达趋势一致。结论 HSP47在日本血吸虫病肝纤维化患者和日本血吸虫病动物模型肝组织中表达均上调,且随Ⅰ型胶原、CTGF、TGF-β1增多呈相同趋势,其有望成为肝纤维化新的诊断标志和治疗靶点。     

血吸虫病肝纤维化小鼠中肝星状细胞迁移功能改变的实验研究

目的探讨影响日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织中肝星状细胞(HSCs)迁移运动功能变化的相关因素。方法 SPF级6⁸周龄Balb/c小鼠16只,随机分为模型组(8只)和对照组(8只),以血吸虫尾蚴腹部贴附法建立感染模型,正常组予以生理盐水代替。于感染后8周末处理小鼠,取部分肝组织石蜡包埋,进行病理学评估,免疫荧光染色检测HSCs(α-SMA,红光)运动蛋白Fascin(绿光)的表达;另取部分肝组织,采用Real-time PCR方法检测迁移诱导因子转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)以及单核细胞趋化因子1(MCP-1)的表达以及HSCs运动蛋白α-SMA、Fascin的表达。结果 8周末时,模型组小鼠肝组织中已形成明显肝纤维化。模型组小鼠肝组织中TGF-β1、PDGF以及MCP-1的基因表达水平分别是对照组的30倍、14倍及14倍,差异具有统计学意义(P=0.033、P=0.039以及P=0.037);同时,模型组中HSCs运动相关蛋白α-SMA和Fascin的基因表达水平分别是对照组的9倍和5倍,差异具有统计学意义(P=0.004、P=0.018);荧光共聚焦结果提示,模型组小鼠肝组织中α-SMA(红色)和Fascin(绿色)表达部位一致,集中在虫卵周围肝纤维化区域,较对照组二者表达明显增加,且红绿光分布多重叠。结论诱导HSCs运动迁移的因子表达增加和HSCs自身的运动相关蛋白表达增加均有利于HSCs运动迁移能力增强。     

TLR4/MyD88在实验性自身免疫性肝炎小鼠中的表达和意义

目的研究Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)在实验性自身免疫性肝炎(experimental autoimmune hepatitis,EAH)小鼠中的表达情况,探讨TLR4/MyD88在自身免疫性肝炎发病中的作用。方法以同种系小鼠肝组织制备的肝抗原S-100与弗氏完全佐剂等体积混合,腹腔注射免疫C57BL/6小鼠建立EAH模型,并设立正常对照组。在EAH组小鼠免疫后28d取肝组织,行石蜡包埋,病理HE染色及Masson胶原染色,免疫荧光检查血清中自身抗体,采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠肝脾组织TLR4、MyD88mRNA相对表达水平,免疫组化检测肝组织中TLR4蛋白水平表达情况。结果与正常组小鼠相比,EAH小鼠肝脏中TLR4、MyD88mRNA明显升高,脾脏中TLR4、MyD88mRNA表达水平下降,肝脏中TLR4蛋白表达增加。结论 TLR4和MyD88在自身免疫性肝炎小鼠肝脏中表达水平升高,可以通过TLR4/MyD88依赖型信号途径发挥作用,并可能促进肝纤维化,在自身免疫性肝炎发生发展过程中发挥重要作用。     

siRNA干预CTGF和TIMP-1对大鼠肝星状细胞胶原分泌的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor,CTGF)和组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-1)对肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)CTGF和TIMP-1基因表达以及对Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响。方法根据已筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,将化学合成siRNA CTGF和siRNA TIMP-1以脂质体LipofectamineTM2000介导,瞬时转染HSC-T6细胞,分别设siRNA CTGF组、siRNA TIMP-1组、siRNA CTGF和siRNA TIMP-1联合组、脂质体组及非特异性(negative control,NC)siRNA组,抽提转染24、48h细胞mRNA和蛋白,并收集细胞上清液。应用RT-PCR鉴定CTGF和TIMP-1mRNA的表达;Western blot检测其蛋白表达;ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌。结果各干预组转染24、48h后分别与脂质体组和NC siRNA组比较,HSC-T6细胞CTGF及TIMP-1mRNA和蛋白表达均明显下调(均P<0.05),且干预组HSC-T6培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显减少(均P<0.05)。siRNA联合组分别与siRNA CTGF组和siRNA TIMP-1组比较,于转染48hsiRNA联合组较siRNA TIMP-1组抑制率高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量比siRNA TIMP-1组少,且差异具有统计学意义(均P<0.05);而与siRNA CTGF组比较,其CTGF mR-NA和蛋白抑制率增高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量较siRNA联合组减少,但差异无统计学意义(均P>0.05)。结论针对HSC-T6CTGF mRNA基因全长943位点和TIMP-1mRNA 304位点化学合成的siRNA,对靶基因mRNA和蛋白表达有较好的抑制效果,CTGF和TIMP-1沉默可显著减少细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;CTGF和TIMP-1两种基因同时沉默,有增强抗肝纤维化效果的可能。