香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的建立与应用

目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝／反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0．183％。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌。16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99．5％以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。     

广东省肇庆市肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性与MLST分型研究

目的 了解广东省肇庆市肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)临床分离株的抗生素耐药情况及多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)特征。方法 收集肇庆市两家医院KP临床分离株63株，采用肉汤微量稀释法进行30种抗生素的体外药物敏感性试验，并对所有菌株进行多位点序列分型。结果 63株KP临床分离株的耐药谱特点可分为4类，即全敏感的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent K. pneumoniae, hvKP)、产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(extended spectrum β-lactamases K. pneumoniae, ESBLsKP)、耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant K. pneumoniae, CRKP)和其他类型的多重耐药肺炎克雷伯菌(multidrug-resistant K. neumoniae，MDRKP)；MLST分型结果显示63株临床分离株可分成41个ST型。其中，ESBLsKP以ST37型(9株，39.13%)为主，CRKP以ST11型(5株，62.50%)为主，hvKP以ST65(5株，25.00%)型和ST23(3株，15.00%)型为主，而其他类型的多重耐药KP的ST型(12株9种ST型)则呈现明显的多态性。结论 我市肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药情况比较严重，要加强院内感染监测，警惕其成为优势菌型并引发院内感染的风险。     

肺炎克雷伯菌耐药表型及分子分型特征分析

目的探讨肺炎克雷伯菌耐药表型及通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析其分子分型,为完善肺炎克雷伯菌分子流行病学特征提供依据。方法收集2018年1-12月肇庆市第二人民医院非重复分离的51株肺炎克雷伯菌为研究对象,采用微量肉汤法进行药敏试验;采用改良产碳青霉烯酶灭活试验(mCIM)检测CRKP表型;采用PFGE进行分子分型,建立PFGE DNA指纹图谱数据库,并运用Bionumeries6.6生物软件进行聚类分析。结果 51株肺炎克雷伯菌根据耐药谱可以分为4个耐药表型,其中产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(产ESBLsKP)28株(54.9%)、耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌(CRKP)4株(7.8%)、多重耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)9株(17.7%)、高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)10株(19.6%)。PFGE聚类分析结果显示,51株菌株间相似度为47.8%～100.0%,可分为47个PFGE型别,PFGE型别相似度85.0%共10株,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型具有100.0%相同PFGE图谱,可以视为4个具有分子流行病学意义的单一克隆群。结论肇庆市第二人民医院肺炎克雷伯菌耐药表型以产ESBLsKP为主,PFGE分型呈多样性,并存在院内散发感染风险,需要注意菌株型别变异趋势。     

2014年肇庆市登革Ⅰ型病毒流行株E基因序列分析

目的：了解肇庆市2014年登革热病Ⅰ型病毒流行毒株E基因序列。方法收集肇庆市2014年登革热患者病例资料及急性期血清,用C6／36细胞培养分离登革热病毒,阳性分离株采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增E基因,绘制系统发生树,进行生物信息学分析。结果36份标本中20份病毒分离培养阳性,获得肇庆市2014年Ⅰ型登革热病毒流行20株毒株的E基因序列,其同源性与中山市的2株流行毒株接近,但与广州市Ⅰ型登革病毒流行株相差较远。结论肇庆市登革热疫情同中山市登革热流行程度相关联且流行特点为输入性流行。     

2019年肇庆市鼠疫及其它鼠传传染病监测分析

目的 对2019年肇庆市鼠疫及肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)、钩端螺旋体病(钩体病)、恙虫病等鼠传传染病流行情况进行监测,为广东省鼠疫及其它鼠传传染病防控策略的制定提供科学依据.方法 系统收集2019年肇庆市高要区5个乡镇的鼠形动物和人间鼠疫及其它...     

肇庆市副溶血性弧菌血清型、毒力基因和脉冲场凝胶电泳分子分型研究

目的 通过副溶血性弧菌血清型、毒力基因和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型研究,建立肇庆市副溶血性弧菌DNA指纹图谱基因库。方法 对肇庆市食物中毒分离出的28株副溶血性弧菌和食品安全风险监测的各类水产品分离的17株副溶血性弧菌进行血清分型,耐热直接溶血素相关基因(trh)和耐热直接溶血素基因(tdh)PCR检测,对45株副溶血性弧菌进行PFGE分子分型。结果 食物中毒分离的28株副溶血性弧菌,血清型以O₄:K₈(32.14%)和O₃:K₆(25.00%)为主,17株水产品分离的副溶血性弧菌,血清型以O₁:K_UT(42.11%)为主;21株(46.67%)为tdh⁺trh^-菌株,23株(51.11%)为tdh^-trh^-菌株,1株(2.22%)为tdh^-trh⁺。45株副溶血性弧菌的PFGE相似值为3.9%~100.0%,被分为36种不同的PFGE型别,带型100%相同的菌株几乎都出现在同一年代相近的时间点,但也出现了跨年代菌株。结论 肇庆市食物中毒的副溶血性弧菌以O₄:K₈和O₃:K₆血清型为主,多数菌株携带tdh基因。PFGE结果提示肇庆市流行的副溶血性弧菌存在多克隆来源。     

基于全基因组分析的肺炎克雷伯菌耐药性与流行病学特征分析

目的 了解肇庆市第二人民医院肺炎患者肺炎克雷伯菌(KP)分离株和医院环境KP分离株的病原学和分子流行病学特征。方法 对该医院2021年收集的49株肺炎患者KP分离株和2株医院环境KP分离株进行抗菌药物敏感性试验鉴定其耐药表型;全基因组测序确定其质粒、分子血清型、多位点序列分型(MLST)、毒力基因与耐药基因等分子特征;基于core-SNPs构建发育进化树,分析优势流行型菌株的进化特征。结果 感染KP的肺炎病患者大部分有基础病(87.76%),年龄>50岁(89.80%)。51株KP耐药表型以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)为主,存在优势耐药谱。携带的质粒主要为IncR、IncFⅡ(pHN7A8)和ColRNAⅠ,且IncFⅡ(pHN7A8)的pMLST为F33:A-:B-型。拥有优势分子血清型和MLST的菌株与优势耐药表型的菌株完全重合,为O_2aK₆₄-ST11 CRKP株。毒力基因和耐药基因显示,51株KP中2株菌株携带脲酶基因ureB。全部菌株携带耐药基因情况严重,且检测出10种不同亚型的β-内酰胺酶基因家族(bla_CT...     

札如病毒实时荧光RT-PCR的建立与应用

目的 建立一种可快速、全面、准确检测人感染札如病毒的TaqMan探针荧光实时RT-PCR方法。方法 利用Bioedit2.0、MAGE6.0软件对可感染人的GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群札如病毒进行保守序列比对,应用Primer6.0、Primer Express 3.0进行引物和TaqMan探针的设计与评价,分别设计了两套引物及TaqMan探针,克隆相应靶基因并构建阳性标准品,建立及优化一步法实时荧光RT-PCR反应体系,并进行灵敏度、特异度、临床标本验证试验。结果 根据基因序列比对分析,札如病毒ORF1与ORF2连接区具有相对高保守序列,针对GⅠ、GⅡ、GⅣ及GⅤ设计了一条共用的下游引物、以及两套上游引物和TaqMan探针,能覆盖当前GenBank可见的感染人的札如病毒基因型,在同一反应管中建立了同时检测札如病毒四个基因群的实时荧光RT-PCR,并可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ进行初步分型,对人柯萨奇病毒、诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等非靶标病原体无扩增,仅对札如病毒有特异扩增,最低检测下限为10拷贝/反应。结论 本研究建立了札如病毒一步法实时荧光RT-PCR反应体系,可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ区分开来,为腹泻疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据。     

广东省肇庆市2014-2015年登革病毒分子分型及初步溯源研究

目的 了解广东省肇庆市2014-2015年登革病毒（DENV）的基因型别和可能的输入来源。方法 收集登革热临床诊断病例急性期血清,对实时荧光反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测阳性标本进行病毒培养,分离株进行E基因扩增与序列测定,用Mega 5.1软件进行分子分型和系统进化树构建。结果 409份样品中147份实时荧光RT-PCR检测阳性（35.94%）,其中2014年阳性144份（39.99%）,以DENV 1（139/361）为主;2015年阳性3份（6.25%）,以DENV 3（2/48）为主。共获得22株DENV分离株,其中20株为2014年DENV 1型的genotype Ⅰ和Ⅲ,与2013-2014年广州、佛山市分离株核苷酸同源性分别为99.40%~100.00%和99.20%~100.00%,与新加坡、泰国、马来西亚和印度尼西亚分离株亲缘关系次之;2株为2015年DENV 3的genotype Ⅲ,与近年新加坡和印度尼西亚分离株的核苷酸同源性为98.20%~99.70%。结论 广东省肇庆市2014年暴发流行的DENV 1为genotype Ⅰ和Ⅲ,可能由广州市和佛山市输入,2015年散发的DENV 3为genotype Ⅲ,由佛山市输入,疫情毒株可能源于新加坡、印度尼西亚等东南亚流行株。     

克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR在食品安全风险监测中的应用

摘要:目的 探讨克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR在婴幼儿奶粉食品安全监测中的应用效果。方法 制备克罗诺杆菌染菌量为1.5×10.0～10.6 CFU/25g奶粉的样品,在增菌 48 h内每隔4 h各取 1 ml 提取 DNA, 进行TaqMan-MGB探针实时荧光PCR,并在婴幼儿奶粉食品安全风险监测中应用,同步进行细菌分离、TaqMan探针实时荧光PCR（美国FDA推荐）,比较3种方法的敏感性和符合率。结果 3种方法可检测到1.5 CFU/25 g奶粉染菌量样本所需增菌培养的时间不一样,TaqMan-MGB探针实时荧光PCR需18 h,美国FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR需24 h,分离培养则需要36 h。TaqMan-MGB探针实时荧光PCR从293份样本的前增菌液中检出15份阳性,从77个可疑菌落中检出23个阳性菌落,鉴定结果与另2种方法一致。结论 克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏,可用于婴幼儿奶粉筛查和辅助鉴定,提高食品安全风险监测的速度和灵敏度。