实时逆转录PCR

实时RT－PCR是一种新技术，它利用荧光实时检测PCR反应，灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子打塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器，即ABI Prism 7 700、Lighteycler和Biorad iCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT－PCR策略，可以将实时RT－PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量，并可通过优化设计，实现多重RT－PCR。     

吡格列酮对脂质诱导胰岛素抵抗大鼠的影响及其机制研究

目的探讨吡格列酮(Pio)对脂质诱导的胰岛素抵抗(IR)大鼠糖代谢、血浆脂联素和抵抗素浓度及组织抵抗素水平的影响。方法采用清醒状态大鼠进行扩展高胰岛素-正糖钳夹术,检测4h脂质灌注升高血浆游离脂肪酸(FFA)引起的IR状态下,肝糖及外周组织糖代谢,血浆脂联素和抵抗素浓度,肝、肌肉、脂肪组织抵抗素水平的变化,以及经Pio处理后的影响。结果在钳夹稳态期,脂质灌注组(L组)和Pio处理+脂质灌注组(P/L组)FFA水平明显较对照组升高。P/L组葡萄糖输注率(GIR)较对照组降低[(20.6±0.9vs 33.6±1.5)mg·kg~(-1)·min~(-1),JP＜0.01],而L组又低于P/L组[(12.6±1.7)vs (20.6±0.9)mg·kg~(-1)·min~(-1),P＜0.01]；对照组和P/L组肝糖输出(HGP)与基础值相比被抑制85%,在L组胰岛素对HGP的抑制作用明显障碍。L组和P/L组葡萄糖清除率(G_(Rd))低于对照组(P＜0.01)。P/L组基础血浆抵抗素水平低于对照组[(7.8±1.3vs 29.1±3.1)μL,P＜0.01]。脂质灌注后P/L组抵抗素浓度明显升高,但仍低于L组[(18.1±3.8vs 47.0±2.2)μg/L,P＜0.01]。P/L组基础血浆脂联素水平明显高于对照组和L组[(3.9±0.2vs 2.8±0.1和2.6±0.2)mg/L,P＜0.01]。但在钳夹结束后,L和P/L组血浆脂联素水平降低(均P＜0.05)。P/L组肝脏抵抗素水平低于对照组和L组(均P＜0.05)；L组骨骼肌抵抗素水平高于对照组和P/L组(均P＜0.05)；各组脂肪组织抵抗素水平差异无统计学意义。结论脂质灌注在体内诱导了一种急性IR。Pio干预部分阻断了脂质诱导的IR。抵抗素和脂联素的变化在IR的发生和发展中可能发挥了一定的作用。     

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测临床标本结核分枝杆菌DNA

目的比较二聚体蝎型探针荧光定量PCR与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）的检出率、检测时间等，探讨二聚体蝎型探针荧光定量PCR检测临床标本中结核分枝杆菌DNA（T＆DNA）的实际应用价值。方法以建立的结核二聚体蝎型探针荧光定量PCR方法为基础，对43例结核确诊患者的标本及11例非肺结核患者的痰标本进行检测，并与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）进行比较。结果二聚体蝎型探针荧光定量PCR能快速准确的检测临床标本中的TB-DNA。其标准品浓度在10^2～10^6copies／μl时，方法能够保持良好的线性关系（相关系数为0．9994），阳性检出率（100％）显著高于抗酸染色法（16．28％）和培养法（37．21％）的检出率，与MTD试验的检出率（100％）一致。MTD试验检测时间约4～5h，而二聚体蝎型探针FQ-PCR检测约需80min即可得到检测结果，检测费用仅为MTD的1／4。结论二聚体蝎型探针荧光定量PCR用于临床标本结核分枝杆菌DNA的检测具有快速价廉、敏感特异的特点，该方法作为定量检测结核分枝杆菌的分子诊断新途径值得临床推广应用。     

生物医学仪器及其实用技术课程建设

通过生物医学仪器及其实用技术课程的建设与实践,探讨该课程开设的必要性、课程组织、实践效果与改进思路,为进一步提高研究生的科研能力和加强实验室的技术队伍建设与仪器设备管理提供保障.     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

高脂诱导胰岛素抵抗大鼠糖代谢及血抵抗素、脂联素水平的变化

目的 探讨高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠糖代谢及抵抗素、脂联素水平的变化。方法 采用大鼠扩展胰岛素钳夹和3-^3H标记葡萄糖示踪技术，估计高脂诱导胰岛素抵抗（IR）大鼠肝糖及外周组织糖代谢的变化，同时采用酶免法检测血浆抵抗素及脂联素水平。结果 高脂喂养组（HF组）大鼠基础血浆游离脂肪酸（FFA）水平明显增高。钳夹稳态时，HF组血浆胰岛素水平明显高于N组，差异有统计学意义（P〈0．01），FFA也明显高于N组，差异有统计学意义（P〈0．01）。HF组葡萄糖输注率（GIR）较N组减少38％，胰岛素介导的葡萄糖利用率（GRd）较N组亦明显减少21％。N组大鼠肝糖输出（HGP）明显抑制达71％，而在HF组胰岛素介导的HGP的抑制作用受到明显障碍（仅抑制30％）。钳夹结束时，N组血浆抵抗素水平与基础值相比明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05），而HF组明显高于N组（P〈0.05）。两组血浆脂联素水平在钳夹后均明显下降差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 高脂饮食诱导大鼠产生了外周和肝脏的IR。IR的形成可能与血浆FFA升高和在高胰岛素状态下较高的血浆抵抗素水平有关。     

实时逆转录PCR

实时RT PCR是一种新技术 ,它利用荧光实时检测PCR反应 ,灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子灯塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器 ,即ABIPrism770 0、Lightcycler和BioradiCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT PCR策略 ,可以将实时RT PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量 ,并可通过优化设计 ,实现多重RT PCR