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目的 应用多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA),建立一种快速筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD) 缺乏症杂合子的临床方法.方法 收集重庆地区2015年1月至2016年7月共429例(男性342例,女性87例) 疑似G6PD缺乏症的患者外周血,采用G6PD/6PGD定量比值法和MMCA法分别检测男性和女性G6PD酶活性和基因突变,以金标准Sanger测序来评价两种方法.同时收集重庆地区进行G6PD缺乏症新生儿疾病筛查的1 754份女性末梢血滤纸片,采用MMCA法筛查G6PD基因突变.结果 429例疑似病例中,G6PD/6PGD定量比值法诊断男性的灵敏度96. 8%、特异性100%,与Sanger测序法一致性好(Kappa = 0. 917,P<0. 05);但女性的灵敏度仅10%,特异性100%,与Sanger测序法一致性差(Kappa = 0. 127,P<0. 05) .MMCA法诊断男性的灵敏度95. 7%,特异性100%,与Sanger测序法一致性较好(Kappa = 0. 891,P<0. 05);女性的灵敏度100%,特异性100%,与Sanger测序法结果完全吻合(Kappa = 1. 000,P<0. 05) .1 754例女性中杂合子占1. 14%(20 /1 754), G6PD酶活性均正常.结论与传统的G6PD/6PGD定量比值法比较,MMCA法检测杂合子灵敏度更高,可用于G6PD缺乏症杂合子筛查,为一种简便、准确的诊断新方法. 相似文献
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目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,
为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA
(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的
细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测
G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外
源PX458 质粒,T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因
c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生
素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,
为后期研究基因的修复奠定了基础。 相似文献
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目的 检测亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶基因分布和外膜孔蛋白OprD2基因缺失情况,了解铜绿假单胞菌的耐药状况.方法 收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所2014-2016年临床分离的非重复铜绿假单胞菌1 887株,VITEK-MS质谱仪进行菌株鉴定,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)法测定其对10种常用抗菌药物的敏感性,利用WHONET5.6软件对药敏资料进行统计分析,同时采用亚胺培南-EDTA纸片法筛选金属酶表型阳性的菌株,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)测铜绿假单胞菌金属β-内酰酶(metallo-β-1actamase,MBL)相关基因(IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM)和外膜孔蛋白OprD2基因的情况.结果 3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为756株(9.4%)、579株(9.5%)和552株(10.7%),主要来自ICU病房和呼吸内科病房,标本类型以痰液为主;2014-2016年分离出的铜绿假单胞菌对妥布霉素、庆大霉素的耐药率逐年下降,其耐药率分别从2014年的11.3%、13.2%下降至2016年的7.8%、9.0%,对左旋氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率呈上升趋势,其耐药率从2014年的10.7%、9.2%上升至2016年的23.5%、11.6%.从基因型分布情况来看,269株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中MBL基因阳性51株(18.9%),外膜孔蛋白OprD2缺失158株(58.7%);51株产酶菌株中VIM型阳性29株,SPM型阳性22株,未检测出其他基因型.结论 铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率较高;产MBL和外膜孔蛋白OprD2基因缺失是引起铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因. 相似文献
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目的 以脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)为金标准,评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在多重耐药铜绿假单胞菌(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDR-PA)同源性分析中应用的可行性.方法 收集陆军军医大学第三附属医院2017年1-12月重症监护病房住院患者分离的20株MDR-PA非重复菌株,利用VITEK MS SARAMIS软件对MDR-PA蛋白图谱进行聚类分析,同时对其进行PFGE同源性分析,并将两种方法所得的分型结果进行对比分析.结果 MALDI-TOF MS同源性分析结果与PFGE同源性分析结果比较显示,20株MDR-PA通过MALDI-TOF MS聚类分析将其分为三大簇(Ⅰ型13株,Ⅱ型6株,Ⅲ型l株),而依据PFGE分型结果则将其分为6种亚型(A型2株,B型3株,C型4株,D型3株,E型7株,F型1株),其中有C型和E型中具有相同基因型菌株间,其MALDI-TOF MS亲缘性关系也较近,而其余4种亚型菌株间亲缘性比较,发现PFGE分型结果与MALDI-TOF MS聚类分析结果不完全相符.结论 与PFGE同源性分析相比,MALDI-TOF MS同源性分析结果一致性不稳定,具有一定局限性,尚不能取代PFGE同源性分析. 相似文献
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