细菌对噬菌体感染的抵抗

噬菌体对其宿主菌具有特异性感染力,反之,宿主菌对噬菌体的感染具有抵抗现象.根据噬菌体侵入宿主的不同阶段,可以将宿主菌对噬菌体的天然抵抗机制分为4个主要的类别吸附抑制,流产感染,限制-修饰系统和穿入阻滞.此外,还有源于噬菌体的抗性作用以及通过人工插入突变获得的广谱噬菌体抗性菌株等.     

铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。     

HSV-1 UL15 exon-Ⅱ的原核表达及抗体制备

目的 构建pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,在大肠埃希菌中高效表达并免疫家兔制备抗体.方法 以HSV-1感染后的Vero细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增HSV-1 UL15 exon-Ⅱ基因,克隆入原核表达载体pQE-31;重组质粒经酶切、测序鉴定无误后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测蛋白表达情况;表达蛋白用Ni-NTA亲和层析纯化及透析复性处理后免疫家兔制备特异性抗体,抗体的免疫原性用Western blotting进行检测.结果 通过RT-PCR扩增获得了HSV-1 UL15 exon-Ⅱ全长基因;构建的pOE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ重组质粒经酶切及测序鉴定无误;阳性转化菌株经WIG诱导后SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的相对分子质量约为43 000,与理论值一致,蛋白表达率约为35%～40%;表达蛋白经纯化及透析复性后免疫家兔获得的抗血清经Western blotting鉴定具有较好的特异性和敏感性.结论 成功构建了pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,诱导蛋白表达并进一步用表达的蛋白制备了特异性抗体,为HSV-1末端酶全长基因表达情况的鉴定及最终构建抗病毒组装药物的分子筛选模型奠定了前期实验基础.     

西南地区基因重组微生物研究生物安全管理的现状调查及对策研究

目的了解西南地区基因重组病原微生物的安全管理现状，并提出相对应的管理办法与措施。方法采用问卷调查的方式对西南地区内从事基因重组微生物研究的实验室从课题承担情况、实验室生物防护和管理情况、人员培训和教育情况等方面进行了抽样调查，对调查结果进行了分析。结果在各实验室，基因重组技术研究和应用范围广泛；有关生物安全的基础设施有待改善，实验室防护级别不够；生物安全规章制度执行力度还有待加强；人员培训有待规范化、制度化。结论应加强有关法规制度和管理体系的建设，注重对人员的宣传、培训和管理以及加强生物防护设施建设等。     

噬菌体基因组PaP1的鸟枪法测序及其生物信息学分析

目的对分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1进行全基因组测序，并进行初步的生物信息学分析，为噬菌体的改造及其治疗奠定基础。方法采用鸟枪法随机测序和重叠群组装的策略对PaP1进行基因组测序，并通过EditSeq、开放读码框架（ORF）finder、GeneMark^TM、BPROM、FindTerm、Palindromes、Equicktandem及FAStRNA等软件对所获得的基因组序列的一般特征、蛋白质同源性序列及tRNA基因等进行分析和预测。结果PaP1基因组约为90000bp，其中最大重叠群为28249bp。在已获得序列中预测出120个ORFs、41个推定基因及9个簇集在5’末端的tRNA基因。在41个推定基因中，预测出编码DNA末端酶大亚单位、DNA解旋酶B亚单位、肽聚糖结合蛋白及3个尾丝蛋白等6个基因的功能。结论鸟枪法只能测出噬菌体基因组PaP1的部分序列，重复序列的存在是该基因组测序困难的原因。     

高温变性对双链DNA分子的损害

高温变性是实验室常用的方法 ,如用煮沸法提取质粒ＤＮＡ ,用煮沸法变性ＤＮＡ检测样品或ＤＮＡ双链探针 ,以及在ＰＣＲ中使用 94℃变性模板等[1～ 3] 。这给我们留下一个强烈印象 :即核苷酸链是耐高温以至可以接受煮沸处理的。基于这一事实 ,最近我们使用煮沸法来灭菌欲无菌保存的ＤＮＡ样品 ,结果意外发现 10 0℃加温处理可以不同程度地损害ＤＮＡ分子 ,引起了我们对高温变性处理双链ＤＮＡ分子的高度重视 ,特设计实验观察高温对ＤＮＡ损害的程度以及高温对不同来源ＤＮＡ的损害是否有差异。现将结果报告如下。1　材料与方法1 1　实验材料…     

Bmi-1调节干性相关分子转录的初步分析

目的 探讨Bmi-1对肿瘤及胚胎干细胞中干性相关分子转录表达的影响.方法 分别构建鼠源和人源Bmi-1过表达载体pCI-GFP-mbmi1和pCI-GFP-hbmi1;瞬时转染鼠ES细胞CCE和人神经胶质瘤细胞U87;半定量RT-PCR检测胚胎干细胞中Oct-4、Nanog、c-Myc、Klf4和Sox2及肿瘤细胞中CD133、Nestin等干性分子的表达;克隆形成实验检测CCE细胞自我更新克隆形成能力.结果 瞬时转染Bmi-1过表达载体后,CCE细胞中Nanog的表达上调,Oct-4、Sox2和Klf4的表达无明显变化;U87细胞中Nestin和Oct-4表达上调,CD133、Nanog变化不明显;两者c-Myc的转录表达均显著降低;过表达Bmi-1促进CCE细胞自我更新克隆形成.结论 Bmi-1参与了对肿瘤及胚胎干细胞中干性相关分子的转录调节.     

伤寒沙门菌bcfD基因的克隆表达

目的构建伤寒沙门菌BcfD基因的原核表达质粒,表达BcfD蛋白。方法PCR法从伤寒沙门菌Ty2菌株基因组中扩增bcfD目的基因,经克隆和亚克隆构建原核表达载体pET-30a-bcf,将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)并进行原核表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达蛋白。结果扩增到与bcfD基因预期大小相符的片段,测序证明与bcfD基因序列完全一致,SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体的形式表达,相对分子质量为42×103,免疫印迹分析表明,表达产物与经用大肠杆菌吸附处理后的伤寒患者血清能进行免疫反应。结论成功构建了bcfD基因原核表达载体并在大肠杆菌中表达了目的蛋白。     

生物信息学教学中学生创新能力培养探讨

生物信息学是一门新兴的交叉学科,其理论和方法不断更新,有助于培养学生的创新能力.结合生物信息学教学实践,从教学团队、教学内容、学生主体作用、实践教学、考核方式等方面,对学生创新能力的培养进行了探索.