血友病A、B诊断试剂盒的研制

血友病是一组遗传性出血性疾病,其中血友病A和血友病B分别因凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)异常而引起.早期的诊断和治疗是防止该类疾病因出血带来不良后果的重要措施.     

镁钙离子诱导的人凝血因子Ⅸ、蛋白C的构象变化及其与相应特异单抗的连接状态

用圆二色光谱、荧光光谱及紫外差光谱研究镁钙离子诱导的ＦⅨ、ＰＣ的构象变化并通过蛋白负染电镜及荧光偏振实验观察了各构象与ＦⅨ、ＰＣ特异单抗的连接状况。ＦⅨ、ＰＣ在镁钙离子诱导下，其３种光谱均发生显著变化，并且与缓冲液中的金属离子浓度有关。ＦⅨ、ＰＣ的特异单抗仅与ＦⅨ、ＰＣ的某种特定构象发生连接反应。     

新型凝血酶原复合物中凝血因子及潜在致血栓性杂蛋白的分析

凝血酶原复合物(PCC)是一种在临床上广泛用于治疗乙型血友病和由肝疾患、维生素K缺乏而继发的Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子缺乏症的血浆蛋白制品,传统的PCC存在病毒污染和潜在诱发血栓形成的高度危险性。本文对笔者所研制的经国际公认灭活病毒有效的有机溶济/表面活性剂(S/D)法处理的新型PCC及传统PCC进行了质量考察,重点对PCC的凝血因子活性及潜在致血栓性的杂蛋白进行分析探讨,结果显示新型PCC的Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的比活性(u/mg)均比传统PCC约高1.5～2.5倍。同时也优于国内同类研制产品(P<0.05)。该结果提示随着新型PCC纯度的提高其相应的血栓副作用得以明显改善。此外,还对制品中与凝血抗凝及纤溶有关的杂蛋白进行了初探以进一步阐明新型PCC的血栓安全性。     

人凝血因子Ⅷ几种冻干保护剂的比较

目的探讨不同冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品在冻干及干热(100℃,30min)过程中的作用。方法同批次人FⅧ样品在相同冻干条件及一定保护剂(0.3%甘氨酸、1.5%蔗糖、1.0%白蛋白)组成的基础上,改变甘氨酸、蔗糖、白蛋白、木糖醇和精氨酸5种冻干保护剂的含量或种类,组合成6组配方,对不同配方冻干及干热后FⅧ制品外观、复溶后澄清度及FⅧ活性等进行分析比较。结果Ⅰ组(3%甘氨酸):冻干和干热后制品成形最好,但复溶后均有少量絮状物;Ⅱ组(5%蔗糖):冻干和干热后制品均萎缩,冻干过程部分制品水份未抽干,冻干后澄清度较好,干热后部分有少量絮状物;Ⅲ组(2%白蛋白):冻干和干热后制品成形较好,但复溶后均有絮状物;Ⅳ组(5%木糖醇):冻干后制品萎缩,复溶后澄清度最好,干热后膨胀,复溶后有大量絮状物;Ⅴ组(1.2%精氨酸):冻干和干热后制品萎缩,但复溶后澄清度均较好;Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸):冻干后制品膨胀,复溶后澄清度较好,干热后进一步膨胀,复溶有大量絮状物。各组冻干后FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率均较高(≥84.2%);干热后差别明显,其中Ⅲ组(2%白蛋白)FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率最高(≥90.4%),而Ⅳ组(5%木糖醇)和Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸)FⅧ活性≤0.94 IU/ml,回收率极低(≤9.8%)。结论在冻干及干热过程中不同冻干保护剂作用差异较大,甘氨酸赋形作用较好,精氨酸对制品中蛋白稳定作用明显,白蛋白对FⅧ活性保护作用最佳;较高浓度的蔗糖不利于冻干过程中水份的去除,木糖醇不适于作为需100℃干热处理的人FⅧ冻干保护剂。     

缺凝血因子Ⅶ血浆的研制及初步性能评价

目的制备缺凝血因子Ⅶ血浆(FⅦDP)并初步评价该FⅦDP的性能。方法利用本实验室建立的抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体(FⅦMcAb)杂交瘤细胞株,采用小鼠体内诱生腹水法和亲和层析法制备高亲和力的FⅦMcAb,并将其偶联至CNBr-Activated Sepharose 4B上,制成FⅦMcAb免疫亲和层析柱,制备FⅦDP;采用凝血一期法检测自制FⅦDP中各凝血因子促凝活性并考察自制FⅦDP的精密度,对比自制FⅦDP和同类进口FⅦDP制品的测定线性范围、比较二者检测不同FⅦ水平样品的效果。结果所制备的FⅦMcAb亚类均被鉴定为IgG1型,利用该FⅦMcAb制备的FⅦDP中FⅦ促凝活性(FⅦ∶C)<1%,而FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C及FⅩ∶C都>70%,均满足正常凝血所需水平;该FⅦDP线性范围在1.625%—200%,3批次自制FⅦDP批内精密度(Sr)分别为3.30、3.36和3.30,批内变异系数分别为4.12%,4.11%,3.98%;批间精密度(Srr)4.20,批间变异系数4.99%,标准曲线的相关系数(r)分别为-0.998、-0.996和-0.996与同类进口制品(r=-0.998)基本一致;经相关分析,该FⅦDP对于不同FⅦ水平的样品的检测效果与同类进口产品一致,r分别为0.97、0.96和0.97。结论初步评价显示FⅦMcAb免疫亲和层析柱研制出FⅦDP性能良好,可作为FⅦ检测试剂使用。     

蝮蛇毒蛋白C激活物的纯化与活性分析

目的探索从国产蝮蛇毒中分离纯化人血浆蛋白C激活物(PCA)的方法及其用于蛋白C的鉴定。方法以国产蝮蛇毒为原料,通过溶解、离心、透析,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Superdex G75凝胶过滤法分离纯化PCA组份。通过SDS-PAGE观察PCA组份的分子量,用发色底物法和凝固法分别测定活化PC(APC)的酰胺酶活性和抗凝活性。结果经两步层析,从蝮蛇粗蛇毒中纯化出PCA组份,SDS-PAGE图谱显示在分子量51 kD左右呈现1条蛋白带;经生物学活性鉴定:该组份在体外能迅速将PC激活为APC,APC的酰胺酶活性(A405)最高约为Protac(唯一商品化的PC激活剂产品)作用的2.8倍,抗凝活性(秒值)最高约为Protac作用的1.4倍,比活性2.20 IU/mg;不同浓度组份激活PC的酰胺酶活性和抗凝活性均随组份浓度的增大而升高,有明显的量效关系。结论采用离子交换层析和凝胶过滤法,可以从国产蝮蛇粗蛇毒中分离纯化出PCA组份,该组份具有较强的激活PC的能力,其生物活性与浓度呈正相关。     

谈谈解决我国当前“血荒”的策略和措施

<正>近期我国已有10多个城市遭遇临床用血严重短缺,即血站采血量无法满足临床用血需求导致的所谓"血荒"。北京、南京、昆明、成都、青岛等城市临床用血纷纷告急,医院许多手术因缺少血液保障,被迫推迟甚至取消,严重者已构成     

从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。     

病毒血清学检测与核酸检测技术在输血传染病筛检中的应用

最近30多年,随着科学技术的迅速发展,输血传染病(或输血传播的疾病)筛检方法与技术也取得了长足进步,对保障输血安全、预防控制输血传染病的传播起到非常重要的作用.输血传染病的筛检方法与技术的进步主要表现在病毒血清学(抗体、抗原)检测方法与技术的不断升级换代,提高了检测的灵敏度和特异性,还表现在病毒核酸检测技术(NAT)的引入和不断改进.现就血液筛检中病毒血清学技术与NAT的应用现状及及今后的发展做一评述.