真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480构建及其促凋亡活性的研究

目的:构建AIF截短后只保留羧基端促凋亡结构域的真核表达载体,了解其是否有促凋亡活性作用及其机制。方法:通过PCR方法构建出AIF截短体AIF△1-480的真核表达载体。采用脂质体将该载体瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,采用流式细胞技术检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用,同时采用JC-1流式细胞技术检测其对线粒体膜电位的影响。选取5～7周龄BALB/c雌性裸鼠35只,构建荷瘤裸鼠模型,并在体内实验中检测该载体的促凋亡活性作用。结果:成功构建真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480,并经酶切鉴定和DNA测序证明。在体外实验中,与对照组相比该载体能够诱导MCF7细胞发生凋亡,对照组、PcDMA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为0.01%、16.01%和28.55%。同时MCF7细胞转染该载体后能够使线粒体膜电位发生去极化,导致凋亡的发生,对照组、PcD-MA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为2.26%、60.37%和95.78%。在荷瘤裸鼠模型中,转染该载体后能够抑制肿瘤的生长,至观察终点中位肿瘤体积分别为1 187.2、1 000.0和609.4mm3。结论:截短后只保留羧基端的AIF仍然有促凋亡活性作用,其机制是通过改变线粒体膜电位来发挥促凋亡作用。     

HER2高表达的人乳腺癌原代细胞模型的建立

目的:探讨人乳腺癌恶性胸水肿瘤细胞的分离、纯化、培养与肿瘤细胞的鉴定,为HER2阳性的人乳腺癌的研究提供肿瘤原代细胞模型.方法:利用淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离、纯化恶性胸水肿瘤细胞,分离得到的细胞培养并传至第5代,通过流式细胞仪分选肿瘤细胞、Q-PCR技术、Western blot技术验证细胞HER2分子的表达水平、通过裸鼠荷瘤实验检测细胞的成瘤能力.结果:淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离得到乳腺癌原代细胞;流式细胞分选结果显示未分选出HER2高表达的肿瘤细胞;Q-PCR及Western blot检测发现分离得到的细胞在mRNA及蛋白水平HER2的表达水平高于乳腺癌MCF-7细胞;裸鼠荷瘤实验结果显示分离得到的细胞可以成功荷瘤.结论:胸水中分离得到的细胞为HER2阳性的乳腺癌原代细胞;对于原代细胞的鉴定需要采用不同的方法加以论证.     

人凋亡诱导因子C-末端截短体AIFΔ1-480的表达对MCF-7细胞的影响

目的观察人亡诱导因子(AIF)C-末端端截短体AIFΔ1-480重组基因表达对MCF-7细胞生物学行为的影响。方法利用脂质体将重组质粒PcDNA3.0-FDT-AIFΔ1-480瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,通过Western blot、流式细胞术、MTT、集落形成试验、线粒体膜电位测定等方法,检测目的基因在细胞中的表达及其对转染细胞凋亡相关分子cytC表达的变化及细胞增殖、凋亡等的影响。结果重组质粒PcDNA3.0-FDT-AIFΔ1-480转染肿瘤细胞后AIF蛋白表达明显增加;重组质粒能明显抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖;上调细胞色素C的表达;减低线粒体膜电位,正常细胞、空载体组和重组质粒的线粒体膜电位(Δψ)分别为4.69±1.07、3.86±1.52和1.51±0.79 mV,重组质粒组与对照组相比,线粒体膜电位明显下降(P<0.05);并诱导细胞凋亡,正常细胞组、脂质体组、PcDNA3.0组、重组质粒组细胞凋亡率分别为:(9.2±5.1)%、(15.4±4.5)%、(20.5±3.9)%、(32.2±6.0)%,重组质粒组与对照组相比,细胞凋亡明显增加(P<0.05)。结论人AIF C-末端端截短体可通过诱导cytC从线粒体中释放促进MCF-7细胞凋亡。     

METTL14调控CCNL2对乳腺癌细胞活性与侵袭的影响

目的探讨甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase like 14, METTL14)通过m6A修饰的方式调控细胞周期蛋白L2(cyclin L2, CCNL2)对乳腺癌(breast cancer, BC)细胞增殖与侵袭的影响。方法收集2018年8月至2020年2月烟台山医院乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织, 高效液相色谱/质谱(HPLC/MS)定量与qRT-PCR检测组织中m6A、METTL14、CCNL2的表达水平。双荧光素酶报告实验、qRT-PCR、Western blot验证METTL14与CCNL2的调控关系。RIP实验验证YTH家族蛋白2(YTH domain-containing family protein, YTHDF2)与CCNL2的调控关系。MTT法检测细胞活性, Transwell检测细胞侵袭能力。结果与正常细胞(0.24±0.02)及组织(0.18±0.02)相比, 乳腺癌细胞MCF-7(0.47±0.03, t=11.05, P<0.001)和HS-578T细胞(0.41±0.03, t=8.17, P=0.001)及乳腺癌组织(0.39±...