TNF-琢对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞自噬和增殖的影响及作用机制研究

目的观察TNF-α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）自噬和增殖的影响,并进一步通过抑制NF-资B通路来探讨这一影响的作用机制。方法以RASF细胞株MH7A为研究对象,在一阶段实验中,根据5ng/mlTNF-琢处理的时间点不同,将细胞分为6组,即0、3、6、12、24及48h组。在二阶段实验中,将细胞分为4组,即Bay组：细胞用5滋g/mlBay11-7082处理;TNF-α组：细胞用5ng/mlTNF-琢刺激;Bay+TNF-琢组：细胞用5滋g/mlBay11-7082预处理2h,再用5ng/mlTNF-琢刺激;正常对照（Ctrl）组：细胞不作处理。MTT法检测细胞相对活性;共聚焦显微镜下采用GFP-LC3来示踪自噬形成;Westernblot法检测细胞内P-p65、自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-I（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）以及唯Bcl-2同源-3域蛋白-1（Beclin-1）蛋白表达水平;Realtime-PCR法检测细胞内Beclin-1mRNA表达水平;细胞免疫荧光法检测P-p65在细胞中表达及定位。结果与0h组相比,12、24、48h组细胞相对活性均明显升高（均P＜0.05）。GFP-LC3-Ⅱ腺病毒转染细胞后,与0h组相比,TNF-琢刺激滑膜细胞后自噬小体形成明显增多,其中24h组最为明显。与0h组相比,3、6、12h组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,6、12、24、48h组Beclin-1蛋白表达水平均明显升高（均P＜0.05）。与0h组相比,6、12、24、48h组Beclin-1mRNA表达水平均明显升高（均P＜0.05）。与TNF-α组相比,Bay+TNF-琢组细胞内P-p65蛋白表达及入核明显减少。与Ctrl组比较,Bay组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降,与TNF-琢组比较,Bay+TNF-琢组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降（均P＜0.05）。与Ctrl组比较,Bay组细胞相对活性明显降低（P＜0.05）;与TNF-琢组比较,Bay+TNF-琢组细胞相对活性明显降低（P＜0.05）。与TNF-琢组相比,Bay+TNF-琢组细胞自噬小体明显减少。与Ctrl组比较,Bay组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降（均P＜0.05）;与TNF-α组比较,Bay+TNF-琢组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降（均P＜0.05）。与Ctrl组比较,Bay组Beclin-1mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）;与TNF-琢组比较,Bay+TNF-α组Beclin-1mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）。结论TNF-α能诱导RASF自噬和增殖活性,而NF-资B通路则能上调TNF-α刺激下的细胞自噬和增殖活性。