CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用

目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blotting检测Fas蛋白的表达。刀豆素A药物处理后MTT法检测细胞增殖,克隆增生法检测细胞增生,AnnexinV/PI荧光双染分析细胞凋亡情况。结果 T7E1酶切分析显示,pX330-Fas-G1质粒的Guide RNA在Fas基因组上产生了有效切割,切割效率为50%;同时Western blotting检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染至HepG2细胞后,与空白质粒pX330-GFP组比较,Fas蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P0.01)。经刀豆素A药物诱导细胞凋亡后,MTT法测定pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组活力值为(68.0±5.0)%,高于非转染细胞组的(51.5±5.8)%,差异有统计学意义(P0.05);克隆增生法检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组在细胞克隆形成数量为(128.8±5.1),高于非转染组的(100.0±9.3),差异有统计学意义(P0.05)。给予刀豆素A药物处理诱导细胞凋亡后,通过Annexin V和PI双染色,采用流式细胞技术检测显示,经pX330-Fas-G1质粒转染后的细胞组有10.0%的细胞为凋亡细胞,低于对照组细胞的33.3%,差异有统计学意义(P0.01)。结论 CRISPR/Cas9系统可通过下调Fas基因的表达来抑制细胞凋亡的进展,为临床开展急性肝衰竭的基因治疗提供理论依据和技术支持。     

左卡尼汀对血液透析患者营养状况及氧化应激的影响

目的 通过观察静脉注射左卡尼汀对维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者营养状态和氧化应激指标的影响.探讨左卡尼汀对MHD患者营养不良及氧化应激状态的治疗作用.方法 选择透析龄超过3 m的MHD患者42例,每次透析结束后,静脉注射左卡尼汀1.0 g,进行为期3 m随访.结果 (1)左卡尼汀治疗3 m后,MHD患者的血白蛋白(P<0.05)和血红蛋白(P<0.01)较治疗前明显升高.血总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平治疗前后无显著差异.(2) MHD患者血浆MDA的平均值均较治疗前明显下降(P<0.01);SOD、GSHPx平均值较治疗前明显上升(P<0.01).结论 左卡尼汀可明显改善患者的营养状态.同时氧化应激状态明显好转.     

Fogarty导管取栓术在人造血管动静脉内瘘血栓形成的应用

目的：观察Fogarty导管取栓术治疗慢性血液透析患者人造血管搭桥动静脉内瘘血栓形成的疗效及并发症。方法：2005年6月～2009年1月12例尿毒症患者Core-Tex膨体聚四氟乙烯（PTFE）人造血管搭桥前臂动静脉内瘘因血栓形成失功行Fogarty导管取栓术。使用EdwardsLifesciences公司4F～7FFogarty导管,切开管腔直视下将血栓取出。确保血栓全部取出后开放血流和缝合血管。术后予低分子肝素抗凝。结果：12例患者人造血管内瘘血栓均被完全取出,开放血管夹后血流恢复。内瘘失功至手术间隔最长时间为12d。7例术后内瘘保持通畅至今1～3年余。3例术后约1年再次发生血栓形成,1例取栓后继续使用,2例虽然再次取栓成功,次日又发生堵塞,予改建另侧血管通路。2例术中发现动脉端近吻合口处有结节样钙化,人造血管内膜变粗糙,虽取栓成功,术后第2天再次堵塞,患者难以再建立血管通路,予改行腹膜透析。1例术中出现上臂贵要静脉破裂,3例导管球囊破裂,无1例发生肺栓塞。结论：应用Fogarty导管能取出人造血管动静脉内瘘血栓,取栓后内瘘能否保持通畅与血管自身条件和回流静脉有无狭窄有关,血管钙化是影响人造血管内瘘通畅的因素之一。确保血栓全部取出是防止肺栓塞并发症发生的关键。     

维持性血液透析患者血小板膜糖蛋白Ibα和相关标志物的表达及意义

目的研究维持性血液透析(MHD)患者外周血血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)、α颗粒膜糖蛋白(CD62P)和溶酶体膜蛋白(CD63)的表达及检测血小板最大聚集率,分析其与健康对照组的差异。方法选取2015年8月至2016年12月期间在中山大学附属第八医院接受MHD的慢性肾衰竭患者49例和体检中心健康人群33例作为研究对象,采用流式细胞术检测MHD患者组和健康对照组外周血血小板膜糖蛋白GPIbα、CD62P和CD63的表达。采用电阻法检测血小板最大聚集率。结果相较于健康对照组,MHD患者组血小板膜糖蛋白GPIbα表达量降低,差异具有统计学意义(P0.01)。CD62P表达升高,差异无统计学意义(P=0.08)。CD63的表达升高,差异具有统计学意义(P0.05)。血小板最大聚集率下降,差异具有统计学意义(P0.01)。MHD患者与健康对照组之间的血小板膜糖蛋白GPIbα、CD63表达和血小板最大聚集率的差异明显。结论MHD患者血小板GPIbα表达下降,血小板最大聚集率降低,血小板聚集功能紊乱激活血小板,而血小板CD63表达升高,血小板进一步活化导致患者高凝状态加剧,可能增加血液透析患者动静脉内瘘血栓形成等事件的发生率。     

同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞增殖和细胞周期的影响及叶酸的拮抗作用

目的：本实验通过研究不同浓度的同型半胱氨酸（homocysteine,HCY）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）增殖和细胞周期的影响,分析可能的细胞损伤机制,探讨 HCY对细胞增殖影响的相关信号通路。同时对叶酸（folic acid,FA）对 HCY 的拮抗作用进行论证,为临床治疗提供理论依据。方法正常人脐静脉内皮细胞体外培养,随机分成6组：HCY低剂量组（1μmol/L）,HCY 中剂量组（10μmol/L）,HCY 高剂量组（100μmol/L）,实验组（10μmol/L HCY＋100μmol/L叶酸）,叶酸组（100μmol/L）及阴性对照组。以 CCK-8法绘制相关组细胞生长曲线;用碘化丙啶单染法检测各组相关的细胞周期;Western-blotting检查周期相关蛋白表达。结果①CCK-8法绘制生长曲线显示,10μm HCY 吸光度明显抑制 HUVECs 的生长,而加入100μM FA后能改善这种抑制作用。②细胞周期分析显示：HCY 作用24 h 后,G0-G1期细胞百分比有明显增加,而 FA 能改善这种作用,表明 HCY 可能通过影响细胞周期的 R 点,使细胞停留在 G0-G1期;高浓度 HCY明显抑制了 S期,但没有明显规律;G2-M期随 HCY 浓度梯度增加,细胞百分比减少,而 FA能改善这种抑制作用。说明 HCY可能也影响了细胞的 M期的分裂过程。③周期相关蛋白表达结果显示 HCY 显著抑制 CDK 4/6的表达量,使细胞阻滞在 G0-G1期。结论 HCY 可通过对细胞周期的抑制作用来抑制 HUVECs的增殖,而叶酸对这种抑制作用具有拮抗作用。HCY 能破坏细胞DNA,使细胞被阻滞在 G1期,同时进入 S、M期的细胞减少。     

腹膜透析患者蛋白质-能量消耗对腹膜炎的影响

目的探讨腹膜透析患者蛋白质-能量消耗(PEW)与腹膜炎发生率的相关性。方法对行维持性腹膜透析(PD)的患者运用改良SGA法评分系统(MQSGA)、营养不良-炎症评分(MIS)和血清总蛋白、白蛋白等进行营养评估,采用酶联免疫方法(ELISA)检测血清超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、白细胞介素-6(IL-6)浓度进行微炎症状态评估,同时检测患者人体学指标、生化指标以及24 h腹透液蛋白丢失量、瘦素等指标。随后将所有患者依据PEW不同分为合并PEW组和非PEW组,比较两组间腹膜炎的发生率。结果 MQSGA和MIS与Hs-CRP、IL-6显著正相关。MQSGA和MIS与身体质量指数(BMI)、中臂围(MAC)、肱三头肌皮褶厚度(TSF)、中臂肌围(MAMC)、白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、血红蛋白(Hb)、尿素氮(BUN)、转铁蛋白(TF)、总铁结合力(TIBC)显著负相关。60例PD患者中,PEW者30例,非PEW者30例。与非PEW组相比,PEW组的MQSGA分值更高,MIS分值更高,PEW组患者BMI、ALB、Scr显著降低,hs-CRP、IL-6、24 h腹透液蛋白丢失量及瘦素显著升高,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。PEW组与非PEW组腹膜炎发生率分别为44.7%和10.0%,PEW组腹膜炎发生率显著高于非PEW组(P0.01)。结论 1MQSGA和MIS可较好评价慢性肾脏病PD患者的PEW,合并PEW的PD患者,其腹膜炎发生率也较高,PEW可预测PD患者发生腹膜炎的风险。2PEW与瘦素水平、24 h腹透液蛋白丢失量、微炎症状态等相关。